中藥筋脈通對糖尿病周圍神經(jīng)病變氧化應(yīng)激及神經(jīng)修復(fù)再生的影響.pdf

1、目的：
　　從整體水平，探討中藥筋脈通對STZ-DM大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織NADPH氧化酶p47phox亞基、NT及NGF表達(dá)的影響;從細(xì)胞水平，探討筋脈通含藥血清對高糖培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元NADPH氧化酶p47phox亞基、NT、NGF表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　第一部分 整體水平
　　采用鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射SD大鼠的方法制造糖尿病模型。隨機(jī)數(shù)字表法將成模大鼠分為3組:糖

2、尿病模型對照組(DM)、筋脈通治療組(JMT)及?；撬嶂委熃M(Tau)，每組各10只。以體重、鼠齡相匹配的正常大鼠10只作為正常對照組(Con)。成模后予灌胃給藥，筋脈通組及?；撬峤M均按成人劑量15倍給藥，模型對照組和正常對照組灌服等量蒸溜水(1ml/100g/d)。分別于治療前及治療后4周、8周、12周及16周檢測各組大鼠體重和血糖變化。所有實驗大鼠于灌胃16周后進(jìn)行機(jī)械痛閾檢測后處死，取大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)組織。采用透射電子顯微

3、鏡觀察DRG超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學(xué)染色法和Westernblotting法檢測大鼠DRG組織中p47phox亞基、NT及NGF蛋白的表達(dá)，實時熒光定量PCR法檢測p47phox及NGF mRNA的表達(dá)。（因NT是酪氨酸硝基化產(chǎn)物，沒有直接編碼的mRNA，所以沒有進(jìn)行PCR檢測）
　　第二部分 細(xì)胞水平
　　1.含藥血清的制各:雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，灌胃蒸餾水（20只）制備正常血清;按成人劑量15倍給藥灌胃筋脈通（10

4、只）、牛磺酸（10只）制備含藥血清。灌胃時間均為1周。
　　2.胎鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的制備:取孕15天(E15)的SD胎鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRGn)，采用混合酶分步消化法、Neurobasal無血清神經(jīng)元專用培養(yǎng)基+B27添加劑+NGF培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)密度梯度離心法、差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞純化，抗MAP-2抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　3.根據(jù)課題組近期研究結(jié)果，確定實驗組分為4組:正常對照組(Con)、高糖組（HG，45

5、mmol/L葡萄糖）、筋脈通組(JMT)、?；撬峤M(Tau)。最佳干預(yù)時間點為貼壁后24小時，后續(xù)指標(biāo)檢測時間點為干預(yù)后24小時，含藥血清添加濃度均為10％。CCK-8法檢測細(xì)胞活性，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。在既往課題組研究結(jié)果——筋脈通含藥血清能抑制高糖培養(yǎng)背根神經(jīng)元活性氧簇(ROS)的基礎(chǔ)上，用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法、Western blotting法檢測DRGn中NADPH氧化酶p47phox亞基、NT及NGF蛋白的表達(dá)，qRT-P

6、CR法檢測p47phox亞基及NGF mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分 整體水平
　　1.血糖和體重:
　　各造模組大鼠血糖與Con組相比均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）;各治療組血糖在同一時間點與DM組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）。
　　干預(yù)前后，同一時間點各治療組大鼠之間的體重?zé)o明顯差異（P均＞0.05）。給藥4、8、12、16周各造模組與Con組相比體重下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)

7、意義（P均＜0.05）。
　　2.機(jī)械痛閾值:
　　與Con組相比，DM組左、右兩側(cè)機(jī)械痛閾均顯著降低(P＜0.01);與DM組比較，JMT組及Tau組兩治療組左側(cè)機(jī)械痛閾提高（P＜0.05），右側(cè)機(jī)械痛閾顯著提高(P＜0.01);兩治療組間比較，左、右兩側(cè)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.透射電鏡觀察背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)的變化:
　　Con組大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)完整清晰，線粒體含量豐富且

8、結(jié)構(gòu)正常，核膜較規(guī)整。DM組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)重度損傷，線粒體腫脹變性，線粒體嵴斷裂、減少甚至消失，大部分呈空泡樣變。JMT組及Tau組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞程度較DM組減輕。
　　4.DRG組織中NADPH氧化酶p47phH亞基、NT及NGF蛋白及mRNA表達(dá)結(jié)果的比較:
　　①免疫組化法結(jié)果顯示:與Con組比較，DM組p47phox亞基、NT表達(dá)顯著升高，NGF表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與DM組比較，JMT組

9、p47phox亞基表達(dá)降低、兩治療組NT表達(dá)均顯著下降，NGF的表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)。與Tau組比較，JMT組NT表達(dá)降低，NGF表達(dá)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。
　　②Western blotting結(jié)果顯示:與Con組比較，DM組p47phox亞基、NT蛋白表達(dá)顯著升高，NGF蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與DM組比較，兩治療組p47phox亞基、NT蛋白表達(dá)顯著下降，NGF的表達(dá)顯著升高(P＜0.0

10、1)。與Tau組比較，JMT組NGF蛋白表達(dá)量升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，p47phox亞基及NT蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05)。
　?、踧RT-PCR結(jié)果顯示:與Con組比較，DM組p47phox亞基mRNA表達(dá)量顯著升高，NGF顯著降低(P＜0.01)。與DM組比較，兩治療組p47phox亞基mRNA表達(dá)量顯著下降，JMT組NGF mRNA的表達(dá)量升高(P＜0.01或P＜0.05)。兩治療組比較，p47phox亞基及

11、NGF mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　第二部分 細(xì)胞水平
　　1.DRGn細(xì)胞調(diào)亡率:
　　與Con組比較，HG組的細(xì)胞調(diào)亡率顯著升高(P＜0.01);與HG組比較，JMT組和Tau組的細(xì)胞調(diào)亡率均顯著降低(P＜0.01)，JMT組和Tau組的細(xì)胞調(diào)亡率與Con組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;JMT組與Tau組之間比較，細(xì)胞調(diào)亡率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.透射電鏡觀察各

12、組DRGn超微結(jié)構(gòu):
　　與整體部分結(jié)果相似，Con組DRGn形態(tài)完整清晰，線粒體含量豐富且結(jié)構(gòu)正常，核膜較完整。HG組DRGn出現(xiàn)明顯損傷，線粒體腫脹變性，線粒體外膜破壞，線粒體嵴斷裂、減少甚至消失，大部分呈空泡樣變。JMT組及Tau組DRGn超微結(jié)構(gòu)病變程度較DM組減輕。
　　3.DRGn細(xì)胞中p47Phox亞基、NT及NGF蛋白及mRNA表達(dá)結(jié)果的比較:
　?、倜庖邿晒饧?xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示:與Con組比較，HG組p

13、47phox亞基、NT表達(dá)顯著升高，NGF表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與HG組比較，兩治療組p47phox亞基及NT的表達(dá)均顯著降低、NGF的表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)。與Tau組比較，JMT組NGF表達(dá)升高，具有統(tǒng)計意義(P＜0.05);p47phox亞基及NT的表達(dá)無差異(P＞0.05)。
　　②Western blotting結(jié)果顯示:與Con組比較，HG組p47phox亞基、NT蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，NG

14、F蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與HG組比較，兩治療組p47phox亞基、NT蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，JMT組NGF的表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，Tau組無差異(P＞0.05)。與Tau組比較，JMT組NGF蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，p47phox亞基及NT蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05)。
　?、踧RT-PCR結(jié)果顯示:與Con組比較，HG組p47phox亞基mRNA表達(dá)顯著升高，NGF mRNA表達(dá)降低或

15、顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。與HG組比較，兩治療組p47phox亞基mRNA表達(dá)顯著下降，NGF的表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。兩治療組比較，p47phox亞基及NGF mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　第一部分 整體水平
　　1.空腹一次性腹腔注射STZ60mg/kg72小時后檢測血糖值大于16.7mmol/L為造模成功。16周后DM大鼠出現(xiàn)痛覺過敏，提示感覺神經(jīng)受累，DPN造

16、模成功。DPN大鼠DRG細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷。
　　2.DPN大鼠背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)損傷，線粒體嵴腫脹，嵴斷裂，甚至空泡樣變。DRG組織中p47phox亞基、NT蛋白及mRNA的表達(dá)顯著升高，NGF蛋白及mRNA的表達(dá)顯著降低。
　　3.筋脈通可改善DPN大鼠痛覺過敏，減輕超微結(jié)構(gòu)損傷，下調(diào)p47phox亞基及NT蛋白及mRNA的表達(dá)，上調(diào)NGF蛋白及mRNA的表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示，中藥筋脈通降低NT及升高NGF蛋白

17、表達(dá)的作用優(yōu)于對照藥?；撬?。
　　第二部分 細(xì)胞水平
　　1.高糖可顯著抑制DRGn細(xì)胞活性，高糖培養(yǎng)DRGn細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞，線粒體損傷明顯。高糖培養(yǎng)DRGn細(xì)胞p47phox亞基和NT蛋白及mRNA的表達(dá)顯著升高，NGF蛋白及mRNA的表達(dá)顯著下降。
　　2.筋脈通含藥血清可提高高糖培養(yǎng)DRGn細(xì)胞活性，降低細(xì)胞凋亡率，減輕超微結(jié)構(gòu)損傷，下調(diào)高糖培養(yǎng)DRGn p47phox亞基及NT蛋白及mRN