構(gòu)建椎體后凸成形術(shù)新型骨填充材料的相關(guān)研究.pdf

1、背景：隨著全球人口的日益老齡化，老年骨質(zhì)疏松癥越來(lái)越受到關(guān)注，是老年人常見(jiàn)病、多發(fā)病，臨床表現(xiàn)為疼痛、身長(zhǎng)縮短、駝背、骨折、呼吸功能下降等，據(jù)估計(jì)我國(guó)目前有骨質(zhì)疏松癥患者90百余萬(wàn)，2015年將達(dá)110百萬(wàn)。骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)退化和骨脆性增加是其三大特點(diǎn)，常導(dǎo)致多種并發(fā)癥發(fā)生，其中最嚴(yán)重的是椎體壓縮性骨折（VCF），即骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折（OVCF），在絕經(jīng)婦女發(fā)生率達(dá)16％，70歲以上老年人為20％。因缺乏有效的治療手段，導(dǎo)致患者生

2、活質(zhì)量急劇下降，引發(fā)各種并發(fā)癥；病變晚期傷椎進(jìn)一步壓縮，疼痛及后凸畸形明顯加重，導(dǎo)致胸腔容積縮小引起心肺功能障礙，甚至死亡。傳統(tǒng)外科手術(shù)具有較大創(chuàng)傷性或因病人特殊情況而無(wú)法手術(shù)。目前在經(jīng)皮椎體成形術(shù)（PVP）基礎(chǔ)上發(fā)展完善的經(jīng)皮球囊擴(kuò)張椎體后凸成形術(shù)（PKP）已成為世界公認(rèn)的、對(duì)此有效的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，但在越來(lái)越多的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)：（a）術(shù)中低壓灌注的骨水泥（PMMA）在固化時(shí)產(chǎn)熱和毒性可引起心跳驟停和脊髓、神經(jīng)根的損傷：（b）骨水泥易滲漏而

3、引起血管栓塞和肺栓塞；（c）骨水泥不能降解，生物相容性差，從而造成永久性異物殘留；（d）病椎日后再骨折時(shí)難以處理，遠(yuǎn)期療效不明顯。在一定程度上限制了此項(xiàng)先進(jìn)治療手段的推廣應(yīng)用。 因此，研制一種生物相容性好、安全性能高、能替代普通骨水泥（PMMA）的新型骨填充材料必然成為老年骨質(zhì)疏松椎體壓縮骨折治療的一大趨勢(shì)。根據(jù)組織工程學(xué)原理采用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）的新型可注射可降解磷酸鈣骨水泥（C

4、PC）構(gòu)建一種具有一定生物力學(xué)強(qiáng)度、良好生物活性，可注射可降解的組織工程化骨，作為經(jīng)皮椎體后凸成形術(shù)理想的填充材料，是當(dāng)今骨組織工程領(lǐng)域研究的一大方向。本研究主要針對(duì)BMSCs的體外分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性、CPC的生物相容性及與BMSC共培養(yǎng)等方面進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為椎體后凸成形術(shù)理想填充材料的研制提供新的科學(xué)依據(jù)。 目的： 1、尋找簡(jiǎn)單可靠的方法對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)與鑒定，并研究其生物學(xué)特性和誘導(dǎo)分化

5、條件，為骨組織工程研究提供大量種子細(xì)胞； 2、評(píng)價(jià)新型可注射可降解磷酸鈣骨水泥的細(xì)胞相容性，為體外構(gòu)建和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)； 3、探討新型可注射磷酸鈣骨水泥與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的可行性，為組織工程化骨的構(gòu)建提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1、取少量健康人骨髓采用Pecoll分離液進(jìn)行密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，用含10％FBS的L-DMEM經(jīng)貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴(kuò)增獲得大量hBMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特

6、性并經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定；分別以成骨誘導(dǎo)液和BMP-2誘導(dǎo)細(xì)胞成骨； 2、采用浸提法制備CPC浸提液，加入到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，MTT法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)增殖率，進(jìn)行細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)：流式細(xì)胞儀檢測(cè)CPC浸提液培養(yǎng)的hBMSCs的細(xì)胞周期；將肝素抗凝的新鮮健康人血用生理鹽水稀釋成2％的人血懸液，在離心管中分別加入CPC生理鹽水浸提液（浸提液原液組、50％原液組）、生理鹽水（陰性對(duì)照組）和雙蒸水（陽(yáng)性對(duì)照組），37℃水浴60 m

7、in，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，計(jì)算紅細(xì)胞溶解率；將浸提液5ml緩緩注入新西蘭白兔的耳靜脈，記錄其體溫值； 3、將新型磷酸鈣骨水泥在不同凝結(jié)時(shí)間分別加入到BMSC濃度為1×107/L的6孔培養(yǎng)板中，逐日觀察材料邊緣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)一周后掃描電鏡觀察；取第三代BMSC，將密度調(diào)至1×107/L加入到12孔培養(yǎng)板，注入糊狀磷酸鈣骨水泥（成團(tuán)期），分別于培養(yǎng)1天、3天、5天、1周終止培養(yǎng)進(jìn)行掃描電鏡觀察。 結(jié)果：

8、 1、經(jīng)密度梯度離心貼壁培養(yǎng)法可較易擴(kuò)增、獲得大量高純度的BMSC，其細(xì)胞形態(tài)、分化特性和表型均符合干細(xì)胞特點(diǎn)，并能在特定培養(yǎng)條件下（OS或BMP-2）向成骨細(xì)胞分化。 2、新型磷酸鈣骨水泥的細(xì)胞毒性反應(yīng)為0～Ⅰ級(jí)，基本無(wú)毒性；對(duì)人血的溶血率<5％，即無(wú)體外溶血作用；白兔體溫波動(dòng)<1℃，無(wú)明顯致熱作用。 3、光鏡下見(jiàn)細(xì)胞在大部分組的CPC材料邊緣生長(zhǎng)良好，未見(jiàn)細(xì)胞變形、壞死；掃描電鏡觀察見(jiàn)大量細(xì)胞緊貼材料生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)良

9、好，細(xì)胞旱不規(guī)則的多角形、近圓形，在骨水泥表面與其他細(xì)胞相連融合成片。 結(jié)論： 1、BMSCs取材方便、對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷小，分離擴(kuò)增容易，利用密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)法可獲得大量高純度的BMSCs；細(xì)胞增殖能力好，定向誘導(dǎo)分化技術(shù)成熟，成骨誘導(dǎo)簡(jiǎn)便易學(xué)握且成骨性能良好，是適合骨組織工程研究的理想種子細(xì)胞。 2、新型可注射性磷酸鈣骨水泥具有良好的生物相容性，符合體內(nèi)植入材料的細(xì)胞毒性要求，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成明顯的不良影響，可以