SNL大鼠Th17細(xì)胞脊髓浸潤及其中樞敏化的可能機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是指“來自外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變或功能紊亂所引起的疼痛”，臨床涉及范圍廣泛，感染、創(chuàng)傷、代謝性疾病、神經(jīng)受壓缺血、放化療等原因均可誘發(fā)，其特征表現(xiàn)為痛覺異常、痛覺過敏、甚至自發(fā)性疼痛。中樞敏化是目前解釋NP的主要理論，脊髓、丘腦、皮質(zhì)水平均可發(fā)生中樞敏化，但關(guān)注最多的還是作為傷害性傳遞的第一中繼站脊髓水平。強(qiáng)烈的傷害性刺激可誘發(fā)活性依賴的中樞敏化，但在NP中，中樞敏化主要?dú)w因于膠質(zhì)

2、細(xì)胞的激活、周圍免疫細(xì)胞的浸潤和慢性神經(jīng)炎癥的形成。
　　 CD4+T細(xì)胞各亞群的平衡失調(diào)與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，包括NP。研究發(fā)現(xiàn)，損傷神經(jīng)局部浸潤的Th1、Th17細(xì)胞與NP的發(fā)展有關(guān)，Th2細(xì)胞作用相反；神經(jīng)損傷后，脊髓內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)有CD4+T細(xì)胞的浸潤，但其具體亞群及其功能目前并不清楚。CNS內(nèi)浸潤的Th17細(xì)胞，是伴有NP疼痛特征的多發(fā)性硬化癥及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)的主要病理損傷者，但其是否直接

3、介導(dǎo)了NP的形成，目前并不清楚。本項(xiàng)目通過體內(nèi)外兩方面研究神經(jīng)損傷后，浸潤至脊髓內(nèi)的CD4+T細(xì)胞的具體亞群，探索Th17細(xì)胞的中樞敏化作用及機(jī)制，為進(jìn)一步了解中樞浸潤的免疫細(xì)胞在NP中的作用積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 研究目的:
　　 (1)神經(jīng)損傷后，周圍CD4+T細(xì)胞遷移并浸潤至脊髓中樞，通過本研究的實(shí)施，旨在闡明浸潤至脊髓中樞的CD4+T細(xì)胞的具體亞群及其浸潤的分子機(jī)制。
　　 (2)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在

4、NP中的作用已得到業(yè)界公認(rèn)，前者與NP的產(chǎn)生有關(guān)，后者則在NP的維持中發(fā)揮重要作用。CD4+Th17細(xì)胞的中樞浸潤處于NP的維持階段，通過本項(xiàng)目的實(shí)施，探索浸潤至脊髓背角的Th17細(xì)胞與活化增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)性及其中樞敏化的可能機(jī)制。
　　 (3)帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(PHN)是臨床上常見的NP疾患，繼發(fā)于帶狀皰疹病毒感染，且好發(fā)于細(xì)胞免疫功能降低的老年人，其發(fā)病似于機(jī)體的免疫功能改變密切相關(guān)。通過本研究，了解PHN患者周圍

5、免疫炎癥水平及其與PHN形成的相關(guān)性；并通過觀察抗中樞敏化治療療效，探索PHN的中樞機(jī)制，為PHN尋找免疫干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 研究方法:
　　 (1)SNL大鼠模型的建立與鑒定
　　 成年雄性SD大鼠，沿L4-S1脊柱中線作-縱行切口，切除L6橫突及L6～S1關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)，游離L5、L6周圍組織，在其遠(yuǎn)端緊結(jié)扎并切斷。假手術(shù)組除不結(jié)扎神經(jīng)外，其余均同手術(shù)組。
　　 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，分別于術(shù)后1、3、5、7、10

6、、14、21天用von Frey纖毛測定大鼠左足和(或)右足機(jī)械痛閾(Up and Down方法)，推算50％機(jī)械縮足閾值(50％MWT)，凡術(shù)后7天50％MWT>4.0 g，即認(rèn)定建模失敗，排除在實(shí)驗(yàn)之外。
　　 (2)FACS分析脊髓浸潤的CD4+T細(xì)胞
　　 暴露大鼠心臟，經(jīng)主動脈灌注NS后，收集L4-L6脊髓，制備單個細(xì)胞懸液，用percoll不連續(xù)密度梯度分離方法收集脊髓中的單個核細(xì)胞，將其重懸于100μL的P

7、BS體系中，分別加入FITC和PE標(biāo)記的抗大鼠CD3、CD4抗體，4℃孵育30min，洗滌后多聚甲醛固定過夜，第二天上機(jī)檢測。
　　 (3)分析脊髓背角浸潤的Th17細(xì)胞
　　 依次用NS和4％多聚甲醛灌注心臟，游離L5-L6脊髓，經(jīng)4％多聚甲醛固定、30％蔗糖沉底、OCT介質(zhì)包埋后，制備14μm冰凍切片，免疫熒光檢測Th17細(xì)胞。另取新鮮的左側(cè)L4-L6脊髓背角組織，RT-qPCR檢測脊髓中促炎因子IL-17 mRNA

8、、轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA、趨化因子CCL2、CCL20、CXCL10 mRNA的表達(dá)情況。ELISA檢測血清中IL-17、IFNγ、IL-4的含量。根據(jù)上述結(jié)果分析Th17細(xì)胞脊髓浸潤及其分子機(jī)制。
　　 (4)Th17細(xì)胞中樞敏化機(jī)制研究
　　 免疫熒光分析左側(cè)L5-6脊髓GFAP的表達(dá)情況，RT-qPCR檢測L5-6脊髓背角促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6 mRNA的含量；體外用不同濃度的IL-17刺激培

9、養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，MTT測定星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況，RT-qPCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子IL-1β、IL-6、TNFαmRNA的表達(dá)。結(jié)合兩者的研究結(jié)果，分析Th17細(xì)胞中樞敏化機(jī)制。
　　 (5)PHN患者免疫疼痛機(jī)制及中樞干預(yù)研究
　　 采集PHN患者外周血，F(xiàn)ACS分析T淋巴細(xì)胞亞群；ELISA檢測血清中IL-12、IL-17、IFNγ、IL-4、IL-15、IL-1α的含量。硬膜外注射抗炎藥物得寶松聯(lián)合或不聯(lián)合

10、鞘內(nèi)注射抗傷害性傳導(dǎo)藥物咪達(dá)唑侖進(jìn)行中樞干預(yù)，評估鎮(zhèn)痛效果及不良反應(yīng)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)20只用于模型制備及鑒定的大鼠，除實(shí)驗(yàn)初期有2只誤被結(jié)扎L4神經(jīng)外，余18只中僅有2只術(shù)后7天50％MWT>4.0 g。脊神經(jīng)結(jié)扎組手術(shù)側(cè)足可見五趾并攏內(nèi)收、輕度外翻、站立姿勢異常及自發(fā)痛形成。L5、L6脊神經(jīng)結(jié)扎后3天，手術(shù)側(cè)足50％MWT為(4.76±4.0)g，顯著低于假手術(shù)組及對照組(P<0.001)；至術(shù)后7天，5

11、0％MWT下降至(1.91±0.98)g(P<0.001)，術(shù)后21天達(dá)最低值(1.16±0.68)g(P<0.001)；右足則在術(shù)后10～14天出現(xiàn)“鏡像痛”。
　　 (2)脊神經(jīng)結(jié)扎后7天，腰段脊髓CD4+T細(xì)胞浸潤明顯增加，占單個核細(xì)胞的10.08％(P<0.001)；浸潤的CD4+T細(xì)胞為Th17細(xì)胞，主要位于脊髓背角淺層，伴有脊髓背角高表達(dá)mRNA IL-17(P<0.05)、RORγt(P<0.05，P<0.01)、

12、CCL2(P<0.01)、CCL20(P<0.05)，CXCL10 mRNA的表達(dá)未見明顯改變。術(shù)后7、14天，脊神經(jīng)結(jié)扎組血清IL-17、IFNγ、IL-4的含量與對照組及假手術(shù)組相比，未見明顯增加。
　　 (3)脊神經(jīng)結(jié)扎后7天，脊髓背角淺層GFAP表達(dá)增加，脊髓背角促炎因子IL-1β、IL-6 mRNA上調(diào)(P<0.01，P<0.05)；IL-6與IL-1β相比，其高表達(dá)的持續(xù)時(shí)間更長，至術(shù)后14天仍顯著高于對照組及假手術(shù)

13、組(P<0.05)；術(shù)后7天、14天，TNF-αmRNA在三組間無顯著差異(P>0.05)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100ng/mL IL-17刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞3天，即可促進(jìn)其顯著增殖，并上調(diào)促炎因子的表達(dá)。
　　 (4)PHN組周圍CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞含量分別為(61.13±9.702)％、(34.2±5.388)％、(26.93±6.273)％，正常對照組分別為(66.73±6.584)％、(37.53±4.37

14、3)％、(29.2±6.002)％，PHN組雖有所下降，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。PHN組血清IL-17、IFNγ、IL-4、IL-12、IL-15、IL-1α的含量亦未見明顯改變(P>0.05)。與基礎(chǔ)值相比，兩種不同方法的抗中樞敏化治療均顯著降低自覺疼痛與觸誘發(fā)痛的VAS評分(P<0.001)，得寶松聯(lián)合咪達(dá)唑侖的中樞干預(yù)措施獲得了更優(yōu)的鎮(zhèn)痛效果，尤其在治療后的6～8W內(nèi)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)結(jié)扎大鼠

15、一側(cè)的L5、L6神經(jīng)，可以成功制備神經(jīng)病理性疼痛SNL模型。該模型制備的成功率高、重復(fù)性好、機(jī)械痛敏出現(xiàn)早且痛閾下降顯著，可較好地模擬PHN患者的灼性神經(jīng)痛。一側(cè)脊神經(jīng)結(jié)扎可致對側(cè)足出現(xiàn)“鏡像痛”現(xiàn)象。
　　 (2)脊神經(jīng)結(jié)扎后，脊髓浸潤的CD4+T細(xì)胞主要為Th17細(xì)胞，其浸潤可能與脊髓背角高表達(dá)的趨化因子CCL2、CCL20相關(guān)。
　　 (3)根據(jù)體內(nèi)外研究結(jié)果，首次提出Th17細(xì)胞參與中樞敏化的可能機(jī)制，即通過其產(chǎn)

16、生的IL-17作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞上的IL-17R，在促進(jìn)其活化增殖的基礎(chǔ)上，使傷害性神經(jīng)元信號得以其為媒介得到迅速擴(kuò)展和維持；另一方面IL-17通過上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的分泌，直接或間接增加了傷害性神經(jīng)元的興奮毒性，也導(dǎo)致NP的維持。此作用機(jī)制也說明了為什么短暫的Th17細(xì)胞浸潤對NP會產(chǎn)生長期的影響。
　　 (4)PHN盡管繼發(fā)于帶狀皰疹病毒感染，好發(fā)于老年人，但從我們的研究結(jié)果來看，PHN患者周圍機(jī)體的免疫炎癥狀態(tài)與健康