鈣調(diào)素抑制劑對(duì)血管性癡呆小鼠認(rèn)知功能損傷的改善作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:隨著社會(huì)人口老齡化和腦血管病發(fā)病率升高，認(rèn)知障礙的患病率和致殘率快速上升，65～85歲人群中認(rèn)知障礙的發(fā)生率為25％，85歲以上可高達(dá)65％。血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由多種復(fù)雜腦血管危險(xiǎn)因素造成，是伴有認(rèn)智能損害和知功能障礙的慢性退行性疾病，具有獲得性和持續(xù)性的特點(diǎn)。VD是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給個(gè)人、家庭和公共醫(yī)療

2、體系造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。頸動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致腦血流供應(yīng)不足等腦血管危險(xiǎn)因素均與VD認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切。慢性腦血流低灌注導(dǎo)致的腦白質(zhì)損傷和認(rèn)知功能障礙在老年人中非常普遍，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。由于缺乏明確的分子機(jī)制和藥物靶點(diǎn)，臨床治療VD多采用促進(jìn)膽堿能系統(tǒng)功能的藥物及改善腦代謝藥物等進(jìn)行對(duì)癥治療，但這些藥物能否延緩大腦功能全面衰退或逆轉(zhuǎn)癡呆病程還有待長(zhǎng)期隨訪觀察。由此，對(duì)癡呆的防治仍是今后醫(yī)藥研究領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，亟需對(duì)血管性癡呆的機(jī)制進(jìn)

3、行深入研究，探尋發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)。
　　VD的發(fā)病機(jī)制是國(guó)際上神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究熱點(diǎn)之一。慢性腦血流低灌注導(dǎo)致腦葡萄糖和氧氣供應(yīng)長(zhǎng)期不足，最終可造成海馬部位神經(jīng)元病理生理改變，如膜磷脂代謝障礙、氧自由基過(guò)多生成、過(guò)量興奮性氨基酸釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等，這些因素作用的綜合結(jié)果是導(dǎo)致該部位膽堿能神經(jīng)元損害，星膠質(zhì)細(xì)胞肥大和增生，小膠質(zhì)細(xì)胞激活，伴有腦白質(zhì)病理性損傷，由此患者最終出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。VD患者人群由于病因的多樣性和病程放的不同，

4、導(dǎo)致抽樣可控性差，其病理生理機(jī)制不同，建立統(tǒng)一的臨床病例納入和排除標(biāo)準(zhǔn)不容易。于此相關(guān)，如何建立能盡可能模擬VD患者病理過(guò)程的動(dòng)物疾病模型也是需要考慮的重要問(wèn)題。原有VD動(dòng)物模型類型龐雜，各自僅模仿VD單方面發(fā)病及病生特點(diǎn)，不能較為全面反映VD的特征。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，VD疾病的分子機(jī)理有新的揭示，加之轉(zhuǎn)基因模式動(dòng)物在研究中突出的優(yōu)勢(shì)，故探索一種可使頸動(dòng)脈狹窄引起長(zhǎng)期慢性腦血流低灌注小鼠模型，對(duì)將來(lái)從分子水平認(rèn)識(shí)VD發(fā)病

5、機(jī)理和開展新藥研究尤為關(guān)鍵。
　　鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)可以激活多種酶或者通道，在神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的代謝、軸漿運(yùn)輸、突觸功能以及遞質(zhì)的合成與釋放等。大量研究表明，Ca2+/CaM信號(hào)紊亂是介導(dǎo)腦缺血病理進(jìn)程的重要因素，參與異常激活Ca2+依賴蛋白激酶如磷脂酶A2和鈣蛋白酶Calpain，以及Ca2+/CaM依賴酶一氧化氮合酶(NOS)和鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CaN)。而磷脂酶A2激活可激發(fā)一

6、系列病理過(guò)程，比如引起花生四烯酸(arachidonic acid，AA)堆積，從而導(dǎo)致AA在環(huán)氧酶及脂氧酶作用下生成前列腺素、白三烯和自由基等活性物質(zhì)，進(jìn)而破壞生物膜而引發(fā)廣泛的炎癥反應(yīng)。其中炎性細(xì)胞分泌大量促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α(tumoral necrosis factor-α，TNF-α)和Fas配體(Fas ligand)，從而引起DNA、蛋白質(zhì)和磷脂降解，

7、引發(fā)缺血性腦損傷。前期發(fā)現(xiàn)針對(duì)上述Ca2+/CaM依存的信號(hào)通路進(jìn)行藥物調(diào)控也可有效保護(hù)急性神經(jīng)血管單元損傷。雖然CaM抑制劑在缺血性腦血管病的防治研究中顯示了其藥理作用，但其是否可減緩或控制VD癥狀及病理過(guò)程還未見報(bào)道。
　　在上述背景下，本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)選擇合適的VD病理模型，探索Ca2+/CaM抑制劑對(duì)VD癥狀及病理過(guò)程的干預(yù)作用及潛在機(jī)制。DY98，3-{2-[4N-（2-甲基-3-氯苯基）-1N-哌嗪基]乙基}-5，6-二甲

8、氧基-1H-吲唑草酸鹽是DY9760e的衍生物，屬于吲唑化合物，一個(gè)用于治療急性腦缺血藥物，尚未市售。DY98作為鈣調(diào)素抑制劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥效學(xué)作用類似DY9760e。有報(bào)道DY9760e可保護(hù)微栓塞導(dǎo)致的血腦屏障損害，減輕腦水腫，是一種有效的抗急性腦缺血損傷保護(hù)劑。故本研究探索DY98其是否具有治療VD認(rèn)知障礙的藥理學(xué)作用。此外，多聚唾液酸(polysialic acid，PSA)是一種位于細(xì)胞表面的，由α-2，8神經(jīng)氨酸組成的線性的

9、、均一多聚的碳水化合物，神經(jīng)細(xì)胞黏附因子(NCAM)是多聚唾液酸的主要載體。PSA作為一種親水的、無(wú)毒和生物可降解的內(nèi)源性聚合物，在藥物載體中也得到了較為廣泛的應(yīng)用。聚合物膠束具有穿透血腦屏障(BBB)的能力。因此基于聚合物膠束的納米藥物傳遞系統(tǒng)，有望提高治療VD藥物的療效，本研究中采用PSA和DY98聯(lián)合給藥也是基于上述目的。
　　本論文主要研究?jī)?nèi)容框架如下:
　　1)本研究首先參照文獻(xiàn)，建立及優(yōu)化小鼠長(zhǎng)期慢性腦血流低灌注

10、血管性癡呆模型。在手術(shù)30d后，采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶功能。另采用轉(zhuǎn)輪法、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)，對(duì)模型小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)關(guān)聯(lián)、焦慮和抑郁功能相關(guān)的行為學(xué)評(píng)價(jià)。
　　2)合成十八胺修飾聚唾液酸(PSA-ODA)，制備載DY98PSA-ODA膠束，并對(duì)其化學(xué)特性進(jìn)行表征。
　　3)采用鈣調(diào)素抑制劑及其PSA膠束，研究對(duì)VD的治療作用及可能機(jī)制。鈣調(diào)素抑制劑DY98(1mg/kg)及其PSA膠束

11、PSA+DY98(7+0.25)mg/kg體重分別灌胃和腹腔注射給藥治療1月后，以Morris水迷宮等方法觀察DY98及其PSA膠束對(duì)慢性腦缺血致認(rèn)知損害的改善作用。
　　通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)研究，取得主要研究結(jié)果如下:
　　一、血管性癡呆小鼠模型優(yōu)化
　　1)小鼠雙側(cè)動(dòng)脈血流阻斷及合并硝普鈉法，模型小鼠手術(shù)前后2h內(nèi)局部腦血流于對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后14-18d和28-32d Morris水迷宮空間記憶功能無(wú)損害

12、，提示該模型不成功。
　　2)雙側(cè)頸動(dòng)脈血流阻斷20分鐘3次，術(shù)后7d Morris水迷宮空間記憶功能損害，死亡率很高。雙側(cè)頸動(dòng)脈血流阻斷20分鐘2次，術(shù)后28d Morris水迷宮空間記憶功能損害，死亡率仍高。雙側(cè)頸動(dòng)脈血流阻斷10分鐘2次，術(shù)后28d Morris水迷宮空間記憶功能無(wú)損害。
　　二、PSA-DY98包和物的合成及特性表征分析
　　1)合成的PSA-ODA聚合物具有兩親性特征，當(dāng)PSA-ODA在水溶液

13、中的濃度高于120μg/mL，可形成聚合物膠束的空間結(jié)構(gòu)?？瞻啄z束的粒徑在水相中為145.7±2.08nm，且具有狹窄的粒徑分布。透射電子顯微鏡觀察到的PSA-ODA空白膠束的粒徑在50nm左右。PSA的羧基基團(tuán)的zeta電位為-33.4±2.56mV。ODA修飾后，PSA-ODA膠束的zeta電勢(shì)下降到-21.2±1.01mV，膠束表面較高的zeta電位，增加聚合物膠束的穩(wěn)定性。
　　2)DY98從載藥膠束中的體外釋放具有緩釋特

14、征。
　　三、鈣調(diào)素抑制劑DY98及其PSA包和物對(duì)VD小鼠的治療作用及機(jī)制研究
　　采用DY98和其PSA包和物對(duì)慢性腦血流低灌注血管性癡呆小鼠藥效學(xué)評(píng)價(jià)及海馬腦區(qū)硝化應(yīng)激、炎癥等相關(guān)信號(hào)分子機(jī)制的探索。主要結(jié)果如下:1)藥效學(xué)研究:與模型對(duì)照組小鼠相比，Morris水迷宮空間探索試驗(yàn)中，DY98(1mg/Kg)高劑量處理組、DY98(0.5mg/Kg)低劑量處理組、PSA(7mg/Kg)處理組、PSA+DY98(0.25

15、mg/Kg)處理組上臺(tái)潛伏期均減少;定位航行試驗(yàn)中，DY98(1mg/Kg)高劑量處理組、PSA(7mg/Kg)處理組上臺(tái)潛伏期均減少;工作記憶試驗(yàn)中，DY98(1mg/Kg)高劑量處理組、PSA(7mg/Kg)處理組、PSA+DY98(0.25mg/Kg)處理組上臺(tái)潛伏期均減少。
　　結(jié)論:
　　1)以水迷宮等作為認(rèn)知功能障礙行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，在小鼠雙側(cè)動(dòng)脈血流阻斷加硝普鈉法、小鼠雙側(cè)動(dòng)脈血流阻斷法、線圈法(頸部動(dòng)脈單側(cè)直徑

16、0.18、0.20mm)致小鼠慢性腦血流低灌注血管性癡呆模型中，以線圈法(頸部動(dòng)脈單側(cè)直徑0.20mm)為最優(yōu)。
　　2)新型鈣調(diào)素抑制劑DY98和其PSA膠束均顯示出對(duì)慢性腦缺血低灌注VD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙有改善作用。
　　3)首次采用多聚唾液酸作為藥物載體負(fù)載鈣調(diào)素抑制劑，并開展藥效學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)0.25mg/kg鈣調(diào)素抑制劑DY98經(jīng)多聚唾液酸載可以起到高劑量組（1mg/kg）同等藥效。提示多聚唾液酸作為藥物載體在

17、提高藥物效應(yīng)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　4)DY98及其PSA膠束通過(guò)減少海馬部位Nitrotyrosine過(guò)量表達(dá)、進(jìn)而減輕硝化應(yīng)激損傷和NLRP3/caspase-1/IL-1β關(guān)聯(lián)炎癥反應(yīng)。經(jīng)由上述機(jī)制，DY98及其包合物增加海馬錐體神經(jīng)元CaMKⅡ蛋白磷酸化水平，改善慢性腦缺血低灌注VD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。鈣調(diào)素抑制劑DY98有望成為治療VD的候選化合物。
　　綜上所述，本研究建立優(yōu)化了小鼠雙側(cè)頸部動(dòng)脈狹窄VD模