晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)小鼠足細(xì)胞裂孔膜主要相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、足細(xì)胞裂孔膜（slit diaphragm，SD）是腎小球?yàn)V膜的重要組成部分。裂孔膜損傷（主要蛋白表達(dá)和功能異常）是多種腎臟病發(fā)生蛋白尿及腎臟病變進(jìn)展的重要機(jī)制。研究證明裂孔膜主要分子nephrin、podocin、CD2AP對(duì)維持裂孔膜正常結(jié)構(gòu)和濾過(guò)屏障功能具有重要作用，三者形成nephrin-CD2AP-podocin復(fù)合物，將裂孔膜鉚釘于足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架上，維持裂孔膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。其表達(dá)和功能的異常與蛋白尿及腎臟病的進(jìn)展有密

2、切關(guān)系。 Nephrin作為足細(xì)胞裂孔膜蛋白的主要分子特異地表達(dá)在腎小球足細(xì)胞上，含胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)三個(gè)結(jié)構(gòu)域，胞外區(qū)與對(duì)側(cè)足突上伸出nephrin分子發(fā)生相互作用，形成拉鏈結(jié)構(gòu)；胞內(nèi)區(qū)可與podocin、CD2AP的分子相互作用，并通過(guò)CD2AP將裂孔膜固定在actin細(xì)胞骨架上。Nephrin對(duì)維持裂孔膜形態(tài)和濾過(guò)屏障的功能具有重要作用，其表達(dá)量和分布的改變均與蛋白尿高度相關(guān)。研究證實(shí)糖尿病腎病時(shí)，在高糖、非酶性糖化白

3、蛋白及球內(nèi)高壓造成的機(jī)械應(yīng)力等環(huán)境下，nephrin基因表達(dá)下調(diào)，并繼發(fā)足突融合及蛋白尿增加。Podocin將nephrin連接在脂筏上，構(gòu)成SD骨架，穩(wěn)定復(fù)合體，并能使nephrin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)。多項(xiàng)臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)糖尿病患者及動(dòng)物模型nephrin、podocin的基因和蛋白水平均有顯著下降。在伴有蛋白尿的腎小球疾?。ň衷罟?jié)段性腎小球硬化、微小病變、糖尿病腎病、IgA腎病等）患者的腎活檢組織中也發(fā)現(xiàn)腎小球nephrin、po

4、docin蛋白表達(dá)低于正常對(duì)照組。CD2AP是nephrin、podocin和細(xì)胞骨架蛋白之間的“鉚釘”，在細(xì)胞骨架和nephrin、podocin之間起著銜接蛋白的作用，將SD固定在actin細(xì)胞骨架上，起到穩(wěn)定SD的作用。CD2AP減少可阻礙nephrin與骨架蛋白和其他裂孔膜分子的結(jié)合而影響裂孔膜和足突形成，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。Nephrin、podocin、CD2AP三者在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面亦有密切聯(lián)系。 晚期氧化蛋白產(chǎn)物（ad

5、vanced oxidation protein products，AOPP）是1996年Witko-Sarsat等從慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）患者血漿中分離的一種含有雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，是由氧化應(yīng)激導(dǎo)致體內(nèi)各種蛋白質(zhì)氧化損傷所形成的終末產(chǎn)物的總稱(chēng)。此后發(fā)現(xiàn)在慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）早期，糖尿病、肥胖等疾病時(shí)均有AOPP的蓄積。本實(shí)驗(yàn)的前期研究證實(shí)，CK

6、D及糖尿病腎病腎組織中AOPP含量增加。越來(lái)越多的證據(jù)表明AOPP具有很強(qiáng)的促氧化及促炎癥作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)外源性AOPP能增加CRF大鼠和糖尿病大鼠的蛋白尿，加重腎臟的炎癥和纖維化病變，正常大鼠給予AOPP負(fù)荷也能導(dǎo)致腎臟損害。AOPP在結(jié)構(gòu)和生物活性上與晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）有許多相似之處，研究證實(shí)AOPP可通過(guò)細(xì)胞表面的RAGE受體介導(dǎo)造成體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮

7、細(xì)胞損傷。最近報(bào)道AGEs通過(guò)足細(xì)胞表面受體RAGE抑制nephrin的表達(dá)。因此假設(shè)具有高度生物活性的AOPP可能對(duì)足細(xì)胞裂孔膜相關(guān)主要蛋白表達(dá)具有病理作用，從而導(dǎo)致腎臟病變。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)應(yīng)用體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞，觀察AOPP對(duì)腎臟固有細(xì)胞足細(xì)胞主要裂孔膜分子nephrin、podocin及CD2AP表達(dá)的影響并同步探討其可能機(jī)制。 研究方法: 1.無(wú)內(nèi)毒素AOPP修飾蛋白的制備與鑒定。 將20mg/ml小鼠血

8、清白蛋白（mouse serum albumin，MSA）與40mmol/L次氯酸等體積混合，室溫放置30min，其摩爾比為1：140 （MSA：次氯酸）。制備的AOPP在無(wú)內(nèi)毒素PBS中透析24h，除去游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后4℃保存。20mg/ml MSA與PBS等體積混合，作為對(duì)照。AOPP含量通過(guò)測(cè)定酸性條件下340nm的光吸收，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)取得。采用鱟試驗(yàn)法檢測(cè)制備的AOPP中內(nèi)毒素含量。 2

9、.小鼠足細(xì)胞MPC5的培養(yǎng)。 小鼠永生性足細(xì)胞MPC5由美國(guó)Dr.Peter Mundel惠贈(zèng)，按其介紹的方法進(jìn)行培養(yǎng)：MPC5在含10%FBS和5u/ml γ干擾素的RPMI-1640，5%CO2，恒溫33℃的孵育箱中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，在含10% FBS的RPMI-1640，5%CO2，恒溫37℃的孵育箱中進(jìn)行分化培養(yǎng)。約10d～14d細(xì)胞分化成熟后，消化調(diào)整細(xì)胞數(shù)接種于六孔板中，用不含血清的RP

10、MI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞獲得同步生長(zhǎng)并處于靜止期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究使用10～18代足細(xì)胞。 3.足細(xì)胞nephrin、podocin、CD2AP mRNA的檢測(cè)。 分化成熟的MPC5與50、100、200及400μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA培養(yǎng)24小時(shí)；與200μg/ml AOPP分別培養(yǎng)6、12、24及48小時(shí)，均以單純培養(yǎng)基為正常對(duì)照組，收集細(xì)胞。加入Trizol試劑按標(biāo)準(zhǔn)

11、程序提取細(xì)胞總RNA；按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，real time-PCR測(cè)定裂孔膜蛋白nephrin、podocin、CD2AP的mRNA表達(dá)。 4.足細(xì)胞nephrin、podocin、CD2AP蛋白的檢測(cè)。 分化成熟的MPC5與50、100、200及400μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA培養(yǎng)24小時(shí)；與200pg/ml AOPP分別培養(yǎng)6、12、24及48小時(shí)，均以單純培養(yǎng)基為正常對(duì)照組；在阻斷實(shí)

12、驗(yàn)中，細(xì)胞分別與ERK1/2特異性阻斷劑PD98059（0.1、1、10μM）、p38特異性阻斷劑SB203580（0.1、1、10μM）、NAD（P）H氧化酶抑制劑apocynin （100μM）、DPI（10μM），預(yù)孵育1h，用200μg/ml AOPP刺激24h，收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白，western blot檢測(cè)nephrin、podocin、CD2AP的蛋白合成。 5.足細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成量檢測(cè)。

13、分化成熟的MPC5與50、100、200及400μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA培養(yǎng)12小時(shí)；與200μg/ml AOPP分別培養(yǎng)3、6、12、及24小時(shí)，均以單純培養(yǎng)基為正常對(duì)照組，裝載熒光探針（DCFH，10μM），收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NAD（P）H氧化酶抑制劑apocynin（100μM）、DPI （10μM）、 線粒體酶復(fù)合體1抑制劑rotenone（2μm）、

14、線粒體酶復(fù)合體2抑制劑TTFA（10μM）、黃嘌呤氧化酶抑制劑allopurinol（100μM）、NO合酶抑制劑L-NAME（100μM）及超氧化物歧化酶（SOD，200單位/ml）預(yù)孵育1h，用200μg/ml AOPP刺激12h，裝載熒光探針，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。 6.NADPH依賴(lài)的超氧陰離子O2-的檢測(cè)。 分化成熟的MPC5與50、100、200及400μg/ml AOPP或200μg/m

15、l未經(jīng)修飾的MSA培養(yǎng)12小時(shí)；與200μg/ml AOPP分別培養(yǎng)0.5、1、6、12及24小時(shí)，均以單純培養(yǎng)基為正常對(duì)照組，收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白。在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NAD（P）H氧化酶抑制劑apocynin （100μM）、DPI （10μM）、 線粒體酶復(fù)合體1抑制劑rotenone（2μM）、線粒體酶復(fù)合體2抑制劑TTFA（10μM）、黃嘌呤氧化酶抑制劑allopurinol （100μM）、NO合酶抑制劑L-NAME

16、（100μM）及超氧化物歧化酶（SOD，200單位/ml）預(yù)孵育1h，用200μg/ml AOPP刺激12h，收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白，用光澤精化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子。 7.足細(xì)胞MAPKs磷酸化的檢測(cè)。 分化成熟的MPC5與50、100、200及400μg/ml AOPP或200μg/ml未經(jīng)修飾的MSA培養(yǎng)6小時(shí)；與200μg/ml AOPP分別培養(yǎng)0.5、1、2、4、6及18小時(shí)，均以單純培養(yǎng)基為正常對(duì)照組

17、，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。Western blot檢測(cè)磷酸化及總ERK1/2、p38、JNK蛋白含量。在阻斷實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別與NAD（P）H氧化酶抑制劑apocynin （100μM）、DPI（10μM）預(yù)孵育1h，用200μg/ml AOPP刺激6h，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)磷酸化及總p38蛋白含量。 8.統(tǒng)計(jì)方法。 所有數(shù)據(jù)均代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有統(tǒng)計(jì)由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS