小鼠足細(xì)胞特異敲除核因子-κB受體活化因子對(duì)蛋白尿的影響.pdf

1、目的：
　　RANK在足細(xì)胞損傷中的意義。
　　損傷足細(xì)胞中RANK的信號(hào)途徑。
　　方法：
　　一、足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠鑒定及表型觀察。
　?。ㄒ唬㏑ABK小鼠的培育及鑒定
　　B6.Cg-Tg(NPHS2-cre)295Lbh/J小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，RANK-loxP鼠由澳大利亞University of Western Australia的鄭銘豪教授提供，在南京大學(xué)-南京

2、生物醫(yī)藥研究院飼養(yǎng)及繁殖。飼養(yǎng)與中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的無(wú)特定病原菌(SPF)環(huán)境中，12小時(shí)光照/黑暗交替，自由進(jìn)食、飲水。留小鼠尾巴提取DNA后進(jìn)行基因型鑒定。普通C57小鼠購(gòu)于中山大學(xué)東校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的無(wú)特定病原菌(SPF)環(huán)境中，12小時(shí)光照/黑暗交替，自由進(jìn)食、飲水。選擇不同基因型的雌性小鼠各6只，年齡為6-8周，體重為20-30g，進(jìn)行表型觀察，內(nèi)容包括:體重和腎臟形態(tài)。
　　二

3、、建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型，觀察三組小鼠腎臟組織病理，足突融合及對(duì)Integrin-β1、integrin-β3、uPAR表達(dá)的影響。
　?。ㄒ唬﹦?dòng)物分組及脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型的建立
　　隨機(jī)選取年齡為6-8周的雌性小鼠經(jīng)基因鑒定為RANK足細(xì)胞特異敲除鼠（RANK-/-），野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠各6只，體重為20-30g。分為C57組（普通C57小鼠），W組（野生型

4、對(duì)照組小鼠）及KO組（足細(xì)胞特異性RANK-/-小鼠）。在LPS前分別收集18只小鼠的24h尿液，檢測(cè)尿量及白蛋白肌酐比。之后給予100μg/只腹腔注射LPS，于24h后收集24h尿液測(cè)量尿量及白蛋白肌酐比。所有小鼠飼養(yǎng)于代謝籠中，自由進(jìn)食和飲水。
　?。ǘ?biāo)本取材及處理
　　分別在給藥前及給藥后第二天收集24h尿液，分別處死三組動(dòng)物。留取腎皮質(zhì)，一部分于液氮罐中長(zhǎng)期保存，另一部分用于病理檢查并制作冰凍切片用于后期免疫熒光

5、實(shí)驗(yàn)，電鏡檢查以及提取蛋白做westernblot實(shí)驗(yàn)。
　?。ㄈ└髦笜?biāo)的檢測(cè)與觀察
　　1、LPS造模后尿白蛋白肌酐比測(cè)定:小鼠腹腔注射LPS后收集24h尿液。按照試劑盒要求，用ELISA法測(cè)定尿液中白蛋白及肌酐的含量，計(jì)算尿白蛋白肌酐比值。
　　2、病理:LPS前后三組小鼠均取腎組織制成石蠟切片行PAS染色，觀察LPS前后三組腎小球和腎小管損傷程度。WT1可作為足細(xì)胞胞核的特異性標(biāo)記用來(lái)計(jì)數(shù)足細(xì)胞。免疫組化:兔抗

6、大鼠WT1(SC-192)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP法按試劑盒說(shuō)明書操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用病理圖像分析軟件做半定量分析，每個(gè)切片隨機(jī)選取10個(gè)腎小球（400倍），對(duì)于WT1染色的切片，在電腦保存400倍圖像的同時(shí)，計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性的足細(xì)胞個(gè)數(shù)。
　　3、電鏡:小鼠腹腔注射LPS后收集完24h尿液，第二天處死。取新鮮腎臟皮質(zhì)標(biāo)本1-2mm3，立即送冰凍切片。美國(guó)FEI透射電鏡(Tecnai G2 SpiritTwin):觀察腎小

7、球基底膜厚度，足細(xì)胞形態(tài)。每只小鼠選擇1-2個(gè)腎小球，對(duì)每個(gè)腎小球隨機(jī)選取10-20個(gè)不同位置進(jìn)行測(cè)定。
　　4、免疫熒光及激光共聚焦:1）.臨用前拿出切片，室溫充分晾干，切忌干片;2）.用1×PBS洗3次×5分鐘/每次;3）.吸取0.5％TritonⅩ-100置于組織上，透化20分鐘;4）.用1×PBS洗3次×5分鐘/每次;5）.滴加5％BSA置于室溫下封閉10分鐘;6）.加一抗在濕盒里，4℃過(guò)夜;7).1×PBS洗3次，每次5

8、分鐘;8）.再于組織上滴加第二種一抗（須與第一種一抗種屬不同）;9）.滴加熒光二抗（用1％BSA稀釋）置于室溫37℃，反應(yīng)60分鐘，注意避光;10）.用1×PBS洗3次×5分鐘/每次;11）.如需做雙重免疫熒光，再滴加第二種二抗于37℃，反應(yīng)60分鐘;12）.用1×PBS洗3次×5分鐘/每次;13）.抗熒光衰減劑封片;14）.濕盒避光放入4℃冰箱待觀察;15）.共聚焦顯微鏡觀察。
　　結(jié)果：
　　一、足細(xì)胞特異RANK基因敲

9、除小鼠的體質(zhì)量，腎臟形態(tài)、重量與野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　將RANK-loxP鼠與NPHS2啟動(dòng)Cre的轉(zhuǎn)基因鼠B6.Cg-Tg(NPHS2-cre)295Lbh/J交配，篩選出同時(shí)含有Cre及RANK兩種基因型的子代小鼠，其足細(xì)胞將缺失RANK基因表達(dá)。在小鼠成年期（6-8周時(shí)），對(duì)6只雌性的RANK-/-小鼠與WT小鼠及普通C57小鼠進(jìn)行比較。C57組小鼠體重（25.47±6.03）vs

10、W組小鼠體重（22.45±2.38）vs KO組小鼠體重(23.72±5.41)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C57組小鼠腎臟重量(1.27±0.05) vs W組小鼠腎臟重量（1.12±0.11）vs KO組小鼠腎臟重量（1.15±0.10）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　二、注射脂多糖(LPS)后，足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠（KO組）蛋白尿較野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠有所減少。
　　實(shí)驗(yàn)前，三組小鼠尿白蛋白肌酐比分別為C5

11、7組（6.34±0.68）vs W組（7.39±1.84）vs KO組（7.40±1.60），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注射LPS后24h，三組小鼠尿白蛋白肌酐比(μg/mg)開(kāi)始顯著升高，提示造模成功。同時(shí)KO組（23.70±9.90）明顯低于野生型對(duì)照組（107.56±22.32）及普通C57小鼠組(132.13±14.26),(P＜0.05)。
　　三、注射脂多糖(LPS)后，三組小鼠腎臟組織病理結(jié)果無(wú)明顯改變，三組小鼠足細(xì)胞數(shù)目均

12、有所下降，但KO組足細(xì)胞數(shù)目較其余兩對(duì)照組下降得更少。
　　四、電鏡下足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的足細(xì)胞足突融合較野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠有所減少。
　　實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠腎臟組織在電鏡下觀察形態(tài)正常，足細(xì)胞無(wú)病變。注射LPS后24h，可以觀察到三組小鼠足細(xì)胞足突出現(xiàn)融合。但在C57組及W組，足細(xì)胞足突融合范圍更廣泛，而KO組足細(xì)胞足突融合情況明顯較對(duì)照組減輕。
　　五、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫

13、蛋白尿模型中，三組小鼠腎臟組織中Integrin-β1、imegrin-β3、uPAR表達(dá)的影響。
　?。ㄒ唬┦褂眉す夤簿劢癸@微鏡觀察雙重免疫熒光染色的小鼠腎臟組織
　　Synaptopodin（綠色熒光）是足細(xì)胞特異性骨架蛋白，可以用來(lái)定位足細(xì)胞。在注射LPS前，三組小鼠Synaptopodin表達(dá)無(wú)差異。已知在正常小鼠腎小球上，RANK（紅色熒光）是微量表達(dá)于足細(xì)胞的。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，注射LPS前，C57組及W組RANK

14、均微量表達(dá)，但KO組無(wú)RANK表達(dá)。在注射LPS后，三組小鼠Synaptopodin表達(dá)均有所下降，且C57組及W組RANK表達(dá)量明顯上升，但KO組依舊無(wú)RANK表達(dá)。提示KO組的確為足細(xì)胞特異性RANK敲除鼠。
　　脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中，三組小鼠腎臟組織中integrin-β1表達(dá)的影響。
　　在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，注射LPS前三組小鼠integrin-β1（紅色熒光）在腎小球上表達(dá)無(wú)明顯差異，與Synap

15、topodin（綠色熒光）共定位。而注射LPS后，三組小鼠integrin-β1的表達(dá)均有所下降，但KO組小鼠相對(duì)其他兩組小鼠integrin-β1表達(dá)的下降有所增加。
　?。ǘ┦褂肳esternblot檢測(cè)三組小鼠腎臟組織中integrin-β1、integrin-β3、uPAR表達(dá)的影響。
　　脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中，三組小鼠腎臟組織中integrin-β1表達(dá)的影響。
　　Western方法

16、檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS后三組小鼠腎臟組織的Integrin-β1表達(dá)均有所下降，但KO組相對(duì)于C57組及W組，Integrin-β1的表達(dá)下降的更多。
　　脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中，三組小鼠腎臟組織中integrin-β3表達(dá)的影響。
　　Western方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS后三組小鼠腎臟組織的Integrin-β3表達(dá)均有所上升，但KO組相對(duì)于C57組及W組，Integrin-β3的表達(dá)上升的更少。
　　結(jié)論：

17、
　　一、足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的體質(zhì)量，腎臟形態(tài)、重量及蛋白尿水平與野生型對(duì)照組(WT)小鼠及普通C57小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　二、在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中，足細(xì)胞特異RANK基因敲除小鼠的蛋白尿水平較其余兩對(duì)照組有明顯減少，提示RANK在足細(xì)胞損傷中具有重要價(jià)值。
　　三、在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中，三組小鼠腎臟組織病理結(jié)果無(wú)明顯改變，三組小鼠足細(xì)胞數(shù)目均有所下降，但KO組足

18、細(xì)胞數(shù)目較其余兩對(duì)照組下降得更少，且電鏡下KO組足突融合較其余兩對(duì)照組有所減少，提示足細(xì)胞特異性敲除RANK基因?qū)ψ慵?xì)胞具有保護(hù)意義。
　　四、在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠短暫蛋白尿模型中，KO組小鼠的integrin-β1表達(dá)較其余兩對(duì)照組小鼠下降的更多，integrin-β3表達(dá)較其余兩對(duì)照組小鼠上升的更少，uPAR的表達(dá)較其余兩對(duì)照組小鼠上升的更少，提示在足細(xì)胞中RANK基因可能通過(guò)與integrin-β1，uPAR及int