基因甲基化模式改變?cè)阡X致認(rèn)知功能障礙及腦內(nèi)Aβ沉積中的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分鋁電解職業(yè)人群基因甲基化模式改變與Aβ的關(guān)系
　　目的：
　　通過(guò)鋁電解職業(yè)人群現(xiàn)況研究檢出 MCI的患病情況，觀察鋁電解職業(yè)人群全基因組，與Aβ相關(guān)的特定基因（APP、BACE1、PS1）甲基化模式改變情況。
　　方法：
　　選取某鋁廠電解車(chē)間工人366人，使用簡(jiǎn)短精神狀態(tài)量表（MMSE）+畫(huà)鐘試驗(yàn)（CDT）篩取 MCI人群，同時(shí)采集空腹抗凝血樣，采用石墨爐原子吸收分光光度法檢測(cè)血清鋁水平；采用甲基化特

2、異性PCR法（MSP）檢測(cè)APP、BACE1和PS1基因甲基化水平；采用ELISA法檢測(cè)全基因組和血清Aβ的含量。同時(shí)應(yīng)用多元線(xiàn)性回歸和logistic回歸分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討MMSE得分以及MCI檢出率的影響因素，并探討血鋁內(nèi)暴露水平、MMSE得分、與全基因組和特定基因甲基化水平（APP、BACE1、PS1）及Aβ表達(dá)的相關(guān)性。采用1:3病例對(duì)照研究，其中MCI為43人，非MCI為年齡、性別及工齡等相匹配的129人。分析鋁暴露水平、全

3、基因和特定基因甲基化以及Aβ表達(dá)的水平。
　　結(jié)果：
　　（1）鋁電解職業(yè)人群血鋁中值濃度為48.99μg/L(范圍從6.63μg/L~158.8μg/L)，并根據(jù)血鋁內(nèi)暴露水平25％和75%可信區(qū)間將鋁作業(yè)工人分為三組：0-34.02μg/L組、34.03-61.42μg/L組和≥61.43μg/L組。
　　（2）MMSE+CDT認(rèn)知量表測(cè)試結(jié)果顯示：不同血鋁水平鋁電解職業(yè)人群的MMSE總分隨著血鋁濃度的增加分別為2

4、8.3±1.3、27.8±1.9和27.1±1.8，不同血鋁水平間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；血鋁≥61.4μg/L組在短時(shí)記憶、計(jì)算力和語(yǔ)言能力較0-34.02μg/L組和34.02-61.42μg/L組差異明顯降低（P<0.05），尤其是短時(shí)記憶力隨著血鋁濃度的增加，降低非常明顯的。CDT測(cè)試結(jié)果顯示：不同血鋁水平鋁電解職業(yè)人群的 CDT分值隨著血鋁濃度的增加分別為3.73±0.96、3.38±1.02和2.41±0.49，

5、三組間差異具有統(tǒng)計(jì)意義。
　?。?）在366例鋁電解工人中檢出MCI為43例（11.7%），其中0-34.02μg/L組有4例（4.4%）、34.02-61.42μg/L組有16例（8.7%）、≥61.43μg/L組23例（25.3%），不同血鋁水平MCI檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　?。?）應(yīng)用多元線(xiàn)性回歸法分析MMSE總分的主要影響因素是年齡、受教育程度、甘油三酯和血鋁水平（P<0.01）。
　　（5

6、）應(yīng)用logistic回歸分析鋁電解職業(yè)人群MCI檢出率與血鋁顯著相關(guān)（OR=2.57，OR的95%CI為1.50~4.41，P<0.01），并且與年齡相關(guān)（OR=1.76，OR的95%CI為1.19~2.62，P<0.05），同時(shí)與受教育程度也有關(guān)（OR=0.356，OR的95%CI為0.19~0.67，P<0.05）。
　　（6）隨著血鋁濃度的增加，鋁電解職業(yè)人群全基因甲基化降低，三組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

7、r>　?。?）甲基化特異性PCR法（MSP）檢測(cè)結(jié)果提示：≥61.43組APP基因甲基化百分率(13.19%)低于0-34.02組(26.37%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同樣，≥61.43組 BACE1基因甲基化百分率(29.67%)低于低血鋁組(40.66%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而PS1基因甲基化百分率有所降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　（8）ELISA法檢測(cè)血清Aβ的含量發(fā)現(xiàn)，34.0

8、3-61.42組、≥61.43μg/L組外周血淋巴細(xì)胞Aβ42含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）采用1:3病例對(duì)照研究，其中MCI為43人，非MCI年齡、性別及工齡等相匹配的129人。
　　①M(fèi)CI的全基因甲基化水平為15.53%，非MCI全基因甲基化水平為17.54%，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　?、贛CI組中發(fā)生APP甲基化的有6例，甲基化百分率為13.95%，而非MCI

9、組中檢出24例，APP甲基化百分率為18.60，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　?、墼贛CI組中發(fā)生BACE1甲基化的為9例，百分率為20.93%，非MCI組檢出37例，百分率為28.68%，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?、躆CI組PS1甲基化為16例，百分率為37.2%，非MCI組發(fā)生PS1甲基化為52例，百分率為40.31%，二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?、菖c非MCI組相比，M

10、CI組外周血淋巴細(xì)胞Aβ42含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　鋁電解職業(yè)人群現(xiàn)況研究結(jié)果提示，長(zhǎng)期鋁暴露可能是引起認(rèn)知功能障礙（MCI），進(jìn)而發(fā)展為阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病危險(xiǎn)因素之一，當(dāng)鋁電解職業(yè)人群全基因低甲基化，特定基因APP和BACE1低甲基化時(shí)，發(fā)生MCI的危險(xiǎn)性可能增大。同時(shí)提示基因甲基化可能參與了鋁致認(rèn)知功能損害的過(guò)程，并且通過(guò)早期血液指標(biāo)的檢測(cè)可能反應(yīng)出腦組織的變化情況。<

11、br>　　第二部分阿爾茨海默病人群基因甲基化模式改變與Aβ的關(guān)系
　　目的：
　　通過(guò)對(duì)阿爾茨海默病(AD)人群現(xiàn)況研究，觀察AD人群全基因組，與Aβ相關(guān)的特定基因（APP、BACE1、PS1）甲基化模式改變情況。
　　方法：
　　使用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表（MMSE）和臨床癡呆評(píng)定量表（CDR）來(lái)評(píng)價(jià)AD人群的認(rèn)知水平及認(rèn)知損害程度，從中選取輕度認(rèn)知功能障礙組（MCI）50人，輕度AD組50人、中度AD組50人以及重

12、度AD組50人。同時(shí)選擇年齡、性別和受教育程度相匹配的正常對(duì)照人群100人。采用石墨爐原子吸收分光光度法檢測(cè)血清鋁水平；采用甲基化特異性PCR法（MSP）檢測(cè)APP、BACE1和PS1基因甲基化水平；采用ELISA法檢測(cè)血清Aβ的含量，分析AD人群血鋁水平、全基因組和特定基因甲基化水平以及Aβ表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）對(duì)照組血鋁中值濃度為33.1μg/L(范圍從6.9μg/L~58.8μg/L)。AD人群血鋁中值濃度

13、為43.5μg/L(范圍從7.9μg/L~65.3μg/L)，AD人群血鋁水平較對(duì)照組有明顯差別的(P<0.05)。
　　（2）MMSE認(rèn)知量表測(cè)試結(jié)果顯示：對(duì)照組的 MMSE總分為28.3±1.3，MCI組為24.6±2.4兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各AD組隨著病情的加重， MMSE總分值降低，分別為22.1±1.9、16.7±2.8和5.8±9.4，與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,并與MCI組比較

14、，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）AD患者M(jìn)MSE問(wèn)卷得分主要與性別、年齡、文化程度和血鋁水平有線(xiàn)性回歸關(guān)系（P<0.01），其中與性別呈負(fù)相關(guān)。
　　（4）對(duì)照組全基因甲基化百分率為19.57%，MCI組全基因甲基化百分率為15.15%；輕度、中度和重度AD組全基因甲基化百分率為14.19%、13.50%和11.17%；與對(duì)照組比較，MCI組和輕度、中度、重度AD組全基因組甲基化水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

15、P<0.05）；與MCI組比較，中度、重度AD組全基因組甲基化水平降低明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）甲基化特異性PCR法（MSP）檢測(cè)結(jié)果顯示：
　　①對(duì)照組APP甲基化百分率(32%)，隨著認(rèn)知損害程度的加重，MCI組和輕度、中度、重度AD組APP甲基化的百分率是降低的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與MCI組甲基化百分率(26%)進(jìn)行比較，輕度、中度、重度AD組的APP異常甲基化的百分率降低明顯，

16、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；
　?、趯?duì)照組BACE1甲基化百分率(37%)，隨著AD病情的加重，輕度、中度、重度BACE1甲基化的百分率是降低的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；
　?、郯柎暮Ｄ∪巳篜S1異常甲基化的百分率,與對(duì)照組甲基化百分率(34%)進(jìn)行比較，PS1基因甲基化的百分率無(wú)降低趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與MCI組甲基化百分率(48%)進(jìn)行比較，輕度AD組和重度AD組的PS1異常甲基化

17、的百分率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　?。?）ELISA法檢測(cè)血清Aβ的含量發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，MCI組和輕度、中度、重度AD組外周血淋巴細(xì)胞Aβ42含量明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與MCI組比較，輕度、中度、重度AD組外周血淋巴細(xì)胞Aβ42含量增加明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　AD人群現(xiàn)況研究結(jié)果提示，高齡、女性、文化水平低和血鋁水平高可能是 AD的高危因素；A

18、D人群的全基因低甲基化，特定基因APP和BACE1也發(fā)生低甲基化，低甲基化的基因可增強(qiáng)基因表達(dá)或過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致AD外周血Aβ的表達(dá)量增高，這與本次鋁電解車(chē)間工人的研究結(jié)果相一致。鋁電解職業(yè)人群的基因甲基化模式改變與AD一致，提示鋁電解職業(yè)人群可能存在和AD人群一樣的DNA甲基化模式。進(jìn)一步證實(shí)DNA甲基化參與了鋁致Aβ沉積相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，這為完善鋁導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙、甚至AD的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　第三部分基因甲基化模

19、式改變?cè)阡X致大鼠腦內(nèi)Aβ沉積的作用機(jī)制研究
　　目的：
　　探討麥芽酚鋁Al(mal)3對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其與腦組織Aβ蛋白沉積相關(guān)基因的甲基化模式改變情況。
　　方法：
　　大鼠采用腹腔注射Al(mal)3進(jìn)行染毒，將40只SD大鼠按體重隨機(jī)分成4組，生理鹽水組，10μM/kg、20μM/kg、40μM/kgAl(mal)3組，每組10只。每天腹腔注射0.1mL/100g，濃度為40mmol/L的Al(

20、mal)3進(jìn)行染毒，對(duì)照組給予等量生理鹽水，連續(xù)5天，休息2天，共8周。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能；處死大鼠取空腹抗凝血樣和腦組織，分別按照以下方法檢測(cè)血、腦組織中各項(xiàng)指標(biāo)。采用石墨爐原子吸收分光光度法檢測(cè)血清鋁和腦鋁水平；測(cè)定全基因組和APP、BACE1和PS1基因甲基化水平；采用qRT-PCR檢測(cè)APP、BACE1和PS1的mRNA表達(dá)水平；采用ELISA法檢測(cè)APP、BACE1、PS1和Aβ蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：

21、
　?。?）水迷宮大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示：在同一天中，各染毒組大鼠的逃避潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而鋁各劑量染毒組大鼠的目標(biāo)象限停留時(shí)間與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，20μM/kgAl(mal)3、40μM/kgAl(mal)3組大鼠穿越平臺(tái)位置次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　?。?）各組大鼠血鋁及海馬鋁檢測(cè)結(jié)果示，與生理鹽水組比，各劑量Al(mal)3

22、染毒組大鼠的血鋁含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨染毒劑量的增加大鼠的腦鋁含量逐漸增多，與生理鹽水組比，20μM/kg、40μM/kgAl(mal)3組大鼠的腦鋁含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　（3）隨Al(mal)3染毒劑量的增加大鼠外周血和海馬全基因組甲基化率降低，與生理鹽水組比，20μM/kg Al(mal)3組、40μM/kg Al(mal)3組的大鼠的全基因組甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。<

23、br>　　（4）甲基化特異性 PCR法（MSP）檢測(cè)結(jié)果提示：APP、BACE1基因甲基化水平是降低的，而PS1基因甲基化水平較生理鹽水組未見(jiàn)明顯變化，并且血和海馬中的變化一致。
　　（5）RT-PCR結(jié)果，20μM/kgAl(mal)3組、40μM/kgAl(mal)3組的海馬APP、BACE1和 PS1基因 mRNA的表達(dá)水平與生理鹽水組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；20μM/kgAl(mal)3組、40μM/kgAl

24、(mal)3組大鼠外周血APP、BACE1基因mRNA的表達(dá)水平與生理鹽水組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而外周血PS1基因mRNA的表達(dá)水平僅40μM/kgAl(mal)3組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　?。?）ELISA法檢測(cè)外周血和海馬APP、BACE1、PS1和Aβ的含量發(fā)現(xiàn)：
　?、匐S Al(mal)3染毒劑量的增加大鼠外周血、海馬中 APP蛋白濃度逐漸增加，與生理鹽水組比，20μM/kg、40μM/k

25、gAl(mal)3組APP蛋白濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　②大鼠外周血、海馬PS1蛋白濃度隨Al(mal)3染毒劑量的增加逐漸增加，與生理鹽水組比，40μM/kg Al(mal)3組PS1蛋白濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　?、鄞笫笸庵苎⒑ｑR中 BACE1結(jié)果，與生理鹽水組相比，20μM/kg、40μM/kgAl(mal)3組的大鼠海馬中BACE1蛋白濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　

26、④與生理鹽水組比，各劑量Al(mal)3染毒組大鼠外周血、海馬Aβ42蛋白濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察鋁致Aβ沉積相關(guān)基因甲基化模式改變情況，以及鋁對(duì)特定基因（APP、PS1、BACE1）的mRNA、蛋白和Aβ表達(dá)水平的影響，并嘗試將全基因、APP和BACE1基因甲基化作為鋁致神經(jīng)毒性的生物標(biāo)志物，進(jìn)而完善鋁神經(jīng)毒性的作用機(jī)制，為鋁毒性從DNA水平進(jìn)行預(yù)防及治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。