葡萄籽原花青素對(duì)高血壓心肌纖維化的保護(hù)作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 葡萄籽原花青素在自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化中的保護(hù)作用及分子調(diào)控機(jī)制研究
　　目的:
　　1.研究GSPE對(duì)SHR抗心肌纖維化的作用。
　　2.研究cofilin-1介導(dǎo)的GSPE抗SHR心肌纖維化的分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　20周齡雄性SHR大鼠24只，分為(1)高劑量GSPE組(SHRH):250mg/kg/d，灌胃

2、，n=8;(2)低劑量GSPE組(SHRL):100mg/kg/d，灌胃，n=8;(3)對(duì)照組(SHRC):生理鹽水，灌胃，n=8。此外，選擇8只WKY鼠做空白對(duì)照(WKYC)，對(duì)比觀察高血壓的進(jìn)展。試養(yǎng)一周進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，治療22周末處死動(dòng)物。
　　2.一般指標(biāo)的測(cè)定
　　(1)血壓及心率檢測(cè):每?jī)芍苣┘疤幩狼巴ㄟ^(guò)BP2006A智能鼠尾無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)檢測(cè)各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓及心率。
　　(2)血液生化指標(biāo)及

3、心衰指標(biāo)的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)前大鼠頸靜脈取血，大鼠處死后心臟取血，檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-C(LDL-C)、N末端腦鈉肽前體(NT-ProBNP)。
　　3.心臟宏觀結(jié)構(gòu)和功能的測(cè)定:
　　(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前及GSPE治療22周末采用二維、M超和組織多普勒超聲心動(dòng)圖技術(shù)檢測(cè)大鼠的左心室結(jié)構(gòu)、收縮和舒張功能變化。
　　(2)大鼠處死前稱量大鼠體重(body weight，BW)及處死后稱量心臟重量

4、(heart weight，HW)，并計(jì)算心臟重量指數(shù)HW/BW(mg/g)。
　　4.心肌病理組織學(xué)的測(cè)定
　　(1)心肌組織纖維化程度的測(cè)定:HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)變化，masson染色觀察膠原纖維面積，天狼星紅染色觀察各型膠原纖維的分布;免疫組化法測(cè)定大鼠心肌組織中α-SMA、collagenⅠ的蛋白表達(dá)情況;
　　(2)心肌超微結(jié)構(gòu)觀察:透射電鏡觀察心肌組織細(xì)胞內(nèi)肌絲、肌節(jié)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基復(fù)合體等超微結(jié)構(gòu)

5、;
　　結(jié)果:
　　1.GSPE對(duì)SHR一般情況的影響
　　實(shí)驗(yàn)前，與WKYC組比較，SHR組在體重方面無(wú)差異(P＞0.05)，在心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓方面均顯著升高（P＜0.01），而SHR組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　GSPE治療22周末，與WKYC組比較，SHR各組在體重方面比較仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但是，在心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓方面比較仍均顯著升高(P＜0.01);

6、與SHR對(duì)照組比較，SHR治療組在心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓方面較低(P＜0.05)，但GSPE治療的高低劑量組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　GSPE治療前后，實(shí)驗(yàn)鼠各組在血脂及心衰指標(biāo)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.GSPE對(duì)SHR心臟宏觀結(jié)構(gòu)及功能的影響
　　(1)心臟超聲指標(biāo):
　　與實(shí)驗(yàn)前比較，GSPE治療22周末，WKYC組舒張功能指標(biāo)E'/A'顯著下降（P＜0.01），IV

7、Sd顯著增厚(P＜0.01)，LVPWd顯著增厚(P＜0.01)。
　　與實(shí)驗(yàn)前比較，GSPE治療22周末，SHR各組舒張功能指標(biāo)E'/A'顯著下降（P＜0.01），LVEF升高（P＜0.01或P＜0.05），LVIDd縮?。≒＜0.01或P＜0.05），IVSd顯著增厚(P＜0.01)，LVPWd顯著增厚（P＜0.01）。
　　實(shí)驗(yàn)前，與WKYC組比較:SHR各組E'/A'顯著下降（P＜0.01），IVSd顯著增厚(P＜0

8、.01)。
　　GSPE治療22周末，與WKYC組比較:SHR各組的E'/A'顯著下降(P＜0.01);SHRC組LVEF升高(P＜0.05);SHR各組IVSd增厚(P＜0.01或P＜0.05)，LVPWd顯著增厚(P＜0.01)。
　　GSPE治療22周末，與SHRC比較:GSPE治療組SHR的E'/A'顯著增加(P＜0.01)，LVEF顯著下降(P＜0.01)，LVIDd增大(P＜0.01或P＜0.05)，IVSd變薄

9、(P＜0.05)，LVPWd變薄(P＜0.01)。
　　GSPE治療22周末，SHRH組與SHRL組比較:E'/A'增加(P＜0.05)，LVEF下降(P＜0.05)，IVSd變薄更顯著（P＜0.05），LVPWd變薄更顯著(P＜0.01)。
　　(2)心臟大體標(biāo)本顯示:與WKYC組比較，SHR各組心臟增大。定量分析心臟重量/體重比值（HW/BWmg/g）。結(jié)果顯示:與WKYC組比較，SHR各組均有增高（P＜0.05或P＜0

10、.01）;與SHRC比較，SHR治療組有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.GSPE能夠顯著抑制SHR的心肌纖維化，對(duì)心肌結(jié)構(gòu)及功能損傷起到保護(hù)作用。
　　2.GSPE通過(guò)抑制cofilin-1、ROCK1蛋白表達(dá)發(fā)揮抗高血壓心肌纖維化的作用。
　　3.SHR心肌中cofilin-1表達(dá)顯著增加，且主要分布于心肌間質(zhì)內(nèi)，在MF中具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分 cofili

11、n-1介導(dǎo)的葡萄籽原花青素抑制心肌成纖維細(xì)胞分化和膠原蛋白合成的分子調(diào)控機(jī)制
　　目的:
　　1.研究cofilin-1在CFs分化及膠原蛋白合成中的分子調(diào)控機(jī)制。
　　2.研究cofilin-1介導(dǎo)的GSPE抑制CFs分化和膠原蛋白合成的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.CFs的培養(yǎng)及分化:
　　(1)在時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)中，人類CFs(human CFs，HCFs)應(yīng)用10 ng/ml的TGFβ-1分別刺

12、激0、24、48和72小時(shí);在濃度梯度實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用0、5、10和50ng/ml的TGFβ-1刺激HCFs48小時(shí)。收集細(xì)胞，提取蛋白，檢測(cè)α-SMA和cofilin-1的表達(dá)情況。
　　(2)根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒的不同，將細(xì)胞分為4組:
　　1)PBS空白對(duì)照組:只加PBS，不加其他干預(yù);
　　2)TGFβ-1刺激對(duì)照組:僅給予TGFβ-1刺激;
　　3)TGFβ-1刺激+LV-CON-RNAi:轉(zhuǎn)染攜帶亂序siRN

13、A慢病毒;
　　4)TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi:轉(zhuǎn)染攜帶CFL-RNAi(28562-1)的慢病毒。
　　1)組給予PBS，2）、3）和4）組給予10ng/ml的TGFβ-1刺激，培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞。
　　(3)根據(jù)GSPE干預(yù)不同，將細(xì)胞分為4組:
　　1)TGFβ-1刺激對(duì)照組;
　　2)TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi;
　　3)GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CF

14、L1-RNAi;
　　4)GSPE+TGFβ-1刺激組;
　　1)和2）組單純應(yīng)用培養(yǎng)基培養(yǎng)，3）和4）組培養(yǎng)基內(nèi)加入GSPE，調(diào)整GSPE濃度為50ug/ml進(jìn)行培養(yǎng)。各組均給予10ng/ml的TGFβ-1刺激48h，收集細(xì)胞。
　　2.倒置熒光顯微鏡:檢測(cè)攜帶報(bào)告基因GFP的慢病毒轉(zhuǎn)染效果。
　　結(jié)果:
　　1.CFs分化對(duì)cofilin-1蛋白表達(dá)的影響
　　Cofilin-1蛋白的表達(dá)呈CFs

15、分化程度依賴性增加，即隨α-SMA蛋白的表達(dá)增強(qiáng)而增強(qiáng)，當(dāng)α-SMA蛋白的表達(dá)最強(qiáng)時(shí)，cofilin-1蛋白的表達(dá)也最強(qiáng)。
　　α-SMA和cofilin-1蛋白表達(dá)呈TGFβ-1刺激時(shí)間依賴性增加(P＜0.01);24小時(shí)開(kāi)始α-SMA和cofilin-1蛋白表達(dá)開(kāi)始顯著增高(P＜0.01)，48小時(shí)達(dá)最高(P＜0.01)，48小時(shí)和72小時(shí)之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　α-SMA和cofilin-1蛋白的表達(dá)呈T

16、GFβ-1刺激濃度依賴性增加(P＜0.01);5ng/mlTGFβ-1刺激組α-SMA和cofilin-1蛋白表達(dá)開(kāi)始顯著增高(P＜0.01)，10ng/mlTGFβ-1刺激組表達(dá)最高，50ng/ml和10ng/ml TGFβ-1刺激組間上述蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.HCFs中慢病毒干擾cofilin-1的效率和效果
　　將CON-RNAi、CFL1-RNAi(28560-1)、CFL1-RNAi(28

17、561-1)及CFL1-RNAi(28562-1)分別轉(zhuǎn)染HCFs，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后觀察慢病毒攜帶的報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)感染效率均大于70％，進(jìn)而收集細(xì)胞、提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果表明， CFL1-RNAi(28560-1)、 CFL1-RNAi(28561-1)及 CFL1-RNAi(28562-1)轉(zhuǎn)染致cofilin-1蛋白表達(dá)分別減少52％、88％和92％，進(jìn)而篩選出最有效的干擾位點(diǎn)CFL1-RNAi(2856