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文檔簡介
1、糖尿病視網(wǎng)膜病變是一種糖尿病微血管病變,是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。糖尿病視網(wǎng)膜病變是50歲以上工作人群重要的致盲眼病,近年來發(fā)病率不斷上升,在發(fā)展中國家的增長速度要高于發(fā)達(dá)國家。我國糖尿病患者中糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率高達(dá)44%-51.3%。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,至今尚未完全闡明。各種細(xì)胞因子在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
炎癥反應(yīng)與糖尿病相關(guān),HMGB1作為一種重要的晚期炎癥介質(zhì),參與糖尿病及其慢
2、性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。炎癥反應(yīng)參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病過程已經(jīng)引起了許多學(xué)者的關(guān)注,糖尿病視網(wǎng)膜病變主要是微血管的病變,內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞損傷引起細(xì)胞凋亡,血管視網(wǎng)膜屏障遭到破壞,血管滲漏性增加,導(dǎo)致了一系列炎癥反應(yīng)及病理過程。HMGB1可由激活的免疫細(xì)胞、壞死細(xì)胞釋放到胞外,并與受體結(jié)合,通過激活核因子-κB的表達(dá)及增加其活性,誘導(dǎo)大量炎性反應(yīng)介質(zhì)的釋放。
細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的主動死亡過程,其在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要
3、作用。糖尿病視網(wǎng)膜病變早期毛細(xì)血管細(xì)胞喪失機(jī)制為細(xì)胞凋亡。隨著凋亡細(xì)胞的數(shù)目增多,一些毛細(xì)血管發(fā)生閉塞,形成視網(wǎng)膜無灌注區(qū),進(jìn)而發(fā)展為無細(xì)胞毛細(xì)血管。糖尿病患者視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的程度明顯高于非糖尿病患者。
高遷移率族蛋白B-1(high mobility group box-1,HMGB1)是一種幾乎存在于所有真核細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)非組蛋白核蛋白。
RNA干擾即將目的基因所對應(yīng)的小分子雙鏈RNA導(dǎo)入生物體,導(dǎo)致相應(yīng)的mRN
4、A降解,從而阻斷細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。RNA干擾技術(shù)是目前新興的研究某個基因功能的有效方法。用干擾RNA特異性地抑制相關(guān)基因,使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài),從而有望用這種新的手段治療疾病,這方面的研究有些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗。
目的:
研究HMGB1參與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管的生成及視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡以及HMGB1siRNA的干預(yù)作用。
方法:
通過STZ腹腔注射方法成功建立糖尿病大鼠模型,觀察大鼠成模
5、情況及生理特點。進(jìn)行大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測及凋亡情況檢測,觀察糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的病理學(xué)特點。視網(wǎng)膜組織石蠟切片免疫組化法檢測HMGB1、NF-κB、VEGF、caspase-3、IL-2的表達(dá)和分布,western blot檢測蛋白表達(dá)量。設(shè)計靶向HMGB1的siRNA,進(jìn)行大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng),然后通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法通過western blot手段在細(xì)胞中觀察siRNA對靶基因的抑制作用。DM16周大鼠按照自身對照的方
6、法分為對照組和干預(yù)組,行siRNA的玻璃體腔注射,視網(wǎng)膜組織切片TUNEL染色,western blot檢測HMGB1、NF-κB、VEGF、caspase-3表達(dá)。
結(jié)果:
成功建立糖尿病大鼠模型,造模成功率98%。實驗前對照組和實驗組大鼠體重和血糖值無明顯差異(t=0.23,0.373,p>0.05)。4w,8w,12w,16w時大鼠體重均低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.252,17.739,26.35
7、6,14.116 P<0.01),血糖均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.578,25.941,28.429,20.959 P<0.01)。糖尿病大鼠模型建立8周開始,實驗組大鼠中逐漸出現(xiàn)虹膜新生血管及白內(nèi)障。16時,共有13只鼠18只眼發(fā)生不同程度的白內(nèi)障。HE染色對照組大鼠視網(wǎng)膜組織病理結(jié)構(gòu)正常,實驗組大鼠12周開始可見到毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜。16周時內(nèi)界膜腫脹、表面不平,視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層水腫。實驗前對照組大鼠與實驗組大
8、鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況無顯著差異(t=1.732,p>0.05)。實驗組大鼠4w時RGC層可見少量TUNEL陽性細(xì)胞,16周時出現(xiàn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的凋亡。與對照組相比,實驗組大鼠4w,8w,12w,16w時細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.201,3.372,11.496,12.186 P<0.01)。
免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示對照組不同時期視網(wǎng)膜內(nèi)HMGB1、NF-κB、VEGF、caspase-3、IL
9、-2陽性細(xì)胞均較少,實驗組各組與對照組相比表達(dá)量增加,免疫組織化學(xué)結(jié)果與Western blot結(jié)果的蛋白表達(dá)趨勢基本吻合。Western blot示對照組大鼠視網(wǎng)膜HMGB1、NF-κB、VEGF、caspase-3、IL-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度均較低。HMGB1實驗組各時間點與對照組相比各因子表達(dá)強(qiáng)度增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.364,4.315,3.686,4.059,p<0.05); NF-κB差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.065,5.
10、187,5.323,11.319,p<0.05),從8周開始統(tǒng)計學(xué)差異顯著(p<0.01)。VEGF表達(dá)量4周、8周與對照組相比無差異(t=0.425,1.468,p>0.05),從12周開始顯著升高(t=4.688,6.041,p<0.01)。Caspase-3實驗組各時間點與對照組相比各因子表達(dá)強(qiáng)度增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.3,3.57,4.01,4.794,p<0.05)。IL-2實驗組各時間點雖較對照組相比均有升高(t=3
11、.521,2.118,9.656,5.89,p<0.05),但是升高趨勢沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化
大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁,純化。Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)染色200×鏡下見大部分細(xì)胞均呈現(xiàn)陽性染色。
HMGB1siRNA轉(zhuǎn)染后視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)量較對照組明顯降低(t=21.802,p<0.01)。干預(yù)組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少,凋亡指數(shù)與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.908,p<0
12、.01),尤其是GCL凋亡陽性細(xì)胞減少明顯。干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜HMGB1,NF-κB,VEGF和caspase-3蛋白表達(dá)量較對照組相比降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.312,4.447,0.425,4.528,p<0.05)
結(jié)論:
1、應(yīng)用STZ腹腔注射方法能夠誘導(dǎo)穩(wěn)定的糖尿病大鼠模型,糖尿病大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)新生血管生成和視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的病理變化。
2、HMGB1在糖尿病視網(wǎng)膜中促進(jìn)NF-κB的表達(dá),促進(jìn)
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