環(huán)境內分泌干擾物對垂體~性腺軸相關基因調控網(wǎng)絡的不良影響及其中藥治療的拮抗作用機制.pdf

1、目的：
　　 (1)通過染毒動物實驗，觀察環(huán)境內分泌干擾物(environmentalendocrine disruptor，EEDs)的擬雌激素作用及中藥對其擬雌激素活性的拮抗作用，以驗證既往的臨床研究結果。
　　 (2)采用功能基因組學方法，研究EEDs對垂體-性腺軸功能相關的基因調控網(wǎng)絡的不良影響及其中藥治療干預的拮抗作用，以闡明中藥拮抗作用的機制。
　　 方法：
　　 (1)以三周齡的雌性SD大鼠

2、為實驗對象，選取具有代表性的EEDs-壬基酚(4-nonylphenol，NP)、雙酚A(bisphenol A，BPA)作為染毒物質，復制NP單獨染毒及NP+BPA聯(lián)合染毒的動物模型，治療組同時喂飼中藥，進行治療干預，療程15天。以子宮濕重、子宮臟器系數(shù)、子宮內膜上皮細胞高度、子宮內膜腺體數(shù)及腺上皮高度，環(huán)形平滑肌厚度、子宮內膜及肌層的細胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白

3、表達水平及雌激素受體蛋白(estrogen receptor，ER)表達水平(免疫組織化學方法)作為檢測指標，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，觀察EEDs的擬雌激素作用及中藥對其擬雌激素活性的拮抗作用。
　　 (2)采用illumina大鼠全基因組表達譜芯片(ratrer-12)，在與垂體-性腺軸功能相關的系列基因中大規(guī)模篩選其表達譜受EEDs染毒后產生顯著變化而中藥治療干預可產生顯著拮抗作用的基因。對篩選出的系列基因再采用實時

4、熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time FQ-PCR)及免疫印跡方法(westernblot)分別從基因表達及蛋白表達的水平進一步加以驗證。結果采用單因素方差分析。
　　 (3)對芯片關注及驗證確定的所有相關基因，按三個功能系列加以分類：
　　 ①垂體促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)及受體后信號轉導通路相關的系列基因。
　　 ②卵巢雌激素受體及受體后信號轉導通路相關的系列基因。
　　 ③卵巢上與雌

5、激素合成代謝相關的系列酶基因。
　　 結果：
　　 (1)染毒組與對照組比較，子宮濕重、子宮臟器系數(shù)、子宮內膜上皮細胞高度、子宮內膜腺體數(shù)及腺上皮高度、環(huán)形平滑肌厚度顯著增加(p<0.05)，子宮內膜及肌層的PCNA蛋白表達、ER蛋白表達顯著增高(p<0.05)。治療組與染毒組相比，上述各指標均明顯降低(p<0.05)。
　　 (2)Illumina Beadchip基因芯片(ratref-12)分析結果顯示，垂

6、體GnRHR及受體后信號轉導通路相關的系列基因中，在染毒及中藥干預治療8天時，LHβ、FSHβ的mRNA均表現(xiàn)為染毒組表達上調、治療組表達下調。GnRH受體后信號轉導通路中的磷脂酶C(PLCd1、PLC11、PLCb2、PLCg2)、二酰甘油DG(DGat2、DGkq)、蛋白激酶CPKC(PrKCb1)、脂氧合酶(Alox15、Alox5、Alox3、Alox12)、白細胞三烯(1tb4r2、1tc4s、1tb4dh)在染毒組表達水平上

7、調，治療組表達水平下調。脂氧合酶Alox15在芯片中表現(xiàn)為差異基因；卵巢雌激素受體及受體后信號轉導通路相關的系列基因中，ERα、ERβmRNA在染毒后8、15天均表達上調、治療后表達下調。ER的共激活因子Sra1、交叉對話的EGF、EGFR、IGFb2、IGFr2 mRNA表達染毒后上調、治療后下調。其中EGFR在芯片上表現(xiàn)為差異基因，變化趨勢與ER相一致；卵巢上與雌激素合成代謝相關的系列酶基因中，染毒組與對照組比較，表達上調的差異基因

8、有stAR、CYP19al。而治療組與染毒組比較，表達水平下調的差異基因有stAR、CYP11A1。
　　 (3)經(jīng)real-time PCR及westernblot進一步驗證結果顯示，NP及BPA染毒可使卵巢ERα、ERβ、EGFR、StAR、CYP19al的mRNA水平顯著上調(p<0.05)，ERα、ERβ、stAR、CYP19al、Cyp11A1蛋白表達明顯增加(p<0.05)；中藥干預則可使ERα、ERβ、EGFR、s

9、tAR、Cyp11a1的mRNA水平顯著下調(p<0.05)，ERα、ERβ、stAR、Cyp11A1蛋白表達顯著減少(p<0.05)。
　　 結論：
　　 (1)通過染毒動物實驗，證實了EEDs的擬雌激素活性及中藥治療干預對其擬雌激素活性具有顯著的拮抗作用，驗證了我們既往的臨床研究結果。
　　 (2)EEDs可顯著促進與垂體-性腺軸功能相關的系列基因的表達水平上調，從而發(fā)揮其擬雌激素活性。
　　 (3)