環(huán)境內分泌干擾物的抗雄激素活性與性腺發(fā)育不良發(fā)病的關系及其中藥拮抗治療的作用機制研究.pdf

1、目的:(1)通過染毒動物實驗，觀察環(huán)境內分泌干擾物(environmental endocrinedisruptor，EEDs)的抗雄激素活性及生殖毒性，復制其引致性腺發(fā)育不良的疾病模型。(2)在此疾病模型上，采用益腎填精中藥治療干預，驗證中藥對EEDs抗雄激素活性及生殖毒性的拮抗作用。(3)采用生物化學及分子生物學實驗方法，從睪丸支持細胞功能角度研究并闡明EEDs抗雄激素活性的作用機制及中藥對其的拮抗作用機制，為開發(fā)有效拮抗EEDs生

2、殖毒性的中藥制劑提供理論依據(jù)。
　　方法:(1)以青春前期（21日齡）雄性SD大鼠為實驗對象，選取具有代表性的EEDs——鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-2-ethylhexylphthalate，DEHP）及氯氰菊酯(Cypermethrin，CYP)作為染毒物質。40只雄性青春前期SD大鼠隨機分為對照組（喂飼玉米油）、DEHP染毒組（喂飼DEHP500 mg/kg）、CYP染毒組(喂飼CYP80mg/kg)及聯(lián)合染毒組（

3、喂飼DEHP500 mg/kg+CYP80mg/kg），每組10只。每日空腹給藥，連續(xù)染毒4周。以睪丸下降時間、包皮分離時間、睪丸濕重、睪丸系數(shù)、血清睪酮水平、睪丸病理組織學改變、睪丸超微結構病變作為指標觀察DEHP及CYP的抗雄激素活性及生殖毒性，復制其引致性腺發(fā)育不良的疾病模型。通過檢測卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)、雄激素結合蛋白(androgen bindi

4、ng protein，ABP)、抑制素(inhibin，INH)、波形蛋白(vimentin，VIM)的基因與蛋白表達水平從睪丸支持細胞功能的角度探討DEHP及CYP抗雄激素活性及其生殖毒性的作用機制。實驗數(shù)據(jù)采用2×2析因方差分析，對比各組間的差異，通過交互圖判斷DEHP與CYP的交互作用。(2)在此性腺發(fā)育不良疾病模型采用益腎填精中藥治療干預。70只雄性SD大鼠隨機分為對照組（喂飼玉米油）、DEHP染毒組(DEHP500 mg/kg

5、)、CYP染毒組(CYP80mg/kg)和聯(lián)合染毒組(DEHP500 mg/kg+CYP80mg/kg)，治療組同時喂飼中藥。每日空腹給藥，連續(xù)染毒4周。以睪丸下降時間、包皮分離時間、睪丸濕重、睪丸系數(shù)、血清睪酮水平、睪丸病理組織學改變、睪丸超微結構病變作為指標，驗證益腎填精中藥對EEDs抗雄激素作用及其生殖毒性的拮抗作用。(3)采用生物化學及分子生物學實驗方法，檢測睪丸組織氧化應激水平，以及FSHR、ABP、INHB、VIM及過氧化物

6、增殖受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的基因與蛋白表達水平。實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，通過染毒組，治療組及對照組的相互對比，從睪丸支持細胞功能的角度探討益腎填精中藥拮抗EEDs抗雄激素活性及生殖毒性的作用機制。
　　結果:(1)與對照組相比，DEHP、CYP單獨及聯(lián)合染毒組睪丸重量、睪丸系數(shù)均顯著降低，睪丸下降及包皮分離時間明顯延遲，血清睪酮水平

7、顯著下降，睪丸組織的氧化應激水平顯著亢進，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），各染毒組睪丸病理組織學及生殖細胞超微結構均可見不同程度的病變。睪丸支持細胞功能相關的基因與蛋白均出現(xiàn)不同程度的改變。各治療組與染毒組相比，上述指標均顯著改善(P＜0.05或P＜0.01)。(2) FQ-PCR方法檢測顯示DEHP及CYP單獨及聯(lián)合染毒睪丸支持細胞FSHR、ABP、INH及VIM的mRNA表達水平顯著下調，PPAR的mRNA表達水平

8、顯著上調(P＜0.05或P＜0.01)，而益腎填精中藥治療干預組睪丸支持細胞FSHR、ABP、INH、VIM的mRNA表達水平顯著上調，PPARγ的mRNA表達水平顯著下調(P＜0.05或P＜0.01)。(3) Western Blot方法驗證，DEHP及CYP單獨及聯(lián)合染毒組睪丸支持細胞FSHR、ABP及INH的蛋白表達顯著下調，PPARγ的蛋白表達顯著上調，而益腎填精中藥干預組FSHR、ABP及INH的蛋白表達水平顯著上調，PPAR

9、γ的蛋白表達顯著下調(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結論:(1)通過染毒動物實驗，我們成功地復制了青春前期大鼠由EEDs引致的性腺發(fā)育不良疾病模型。(2) DEHP及CYP均具有顯著的抗雄激素活性及生殖毒性，并顯著促進睪丸組織的氧化應激反應。DEHP對睪丸支持細胞具有顯著毒性，可明顯降低睪丸支持細胞功能相關的基因與蛋白表達，CYP對睪丸支持細胞的毒性作用較弱。二者聯(lián)合染毒呈一定拮抗效應。(3)益腎填精中藥對EEDs的抗雄激素