腺苷酸環(huán)化酶激活劑誘導(dǎo)脆性X智力低下一號基因重新表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景:
　　 脆性 X綜合征[fragile X syndrome,Fra(X)]是最常見的遺傳性智力低下性疾病之一。據(jù)保守估計(jì),我國至少有20萬脆性 X病人,由于病人壽命正常,而智力低下,沒有獨(dú)立生活的能力,因此對家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。
　　 目前認(rèn)為Fra(X)致病機(jī)制主要是脆性X智力低下一號基因(fragile X mentalretardation-1 gne,FMR1)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)存在(CGG)n三核苷酸

2、重復(fù)序列的不穩(wěn)定擴(kuò)增及其上游的 CpG島的異常甲基化,這些突變使FMR1基因轉(zhuǎn)錄受到抑制,導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)減少或缺如,最終表現(xiàn)為 Fra(X)。目前認(rèn)為,CpG島有無異常甲基化比CGG重復(fù)數(shù)對表型的影響更為重要。Pietrobono R發(fā)現(xiàn)在無 DNA甲基化的情況下,CGG重復(fù)序列的擴(kuò)增本身并不阻止FMR1的翻譯以及FMRP的產(chǎn)生。已有

3、病例報(bào)道,患者FMR1基因(CGG)n已擴(kuò)增至完全突變,但由于CpG島未甲基化,FMRP仍能正常表達(dá),所以智力表現(xiàn)正常。從而提示有無甲基化也許是使FMR1基因轉(zhuǎn)錄沉默和相應(yīng)蛋白表達(dá)缺如的主要原因。
　　 FMRP的減少或缺如,最終表現(xiàn)為脆性X綜合征。FMRP是RNA結(jié)合蛋白,可通過轉(zhuǎn)運(yùn)靶RNA對轉(zhuǎn)錄水平的剪切,RNA轉(zhuǎn)運(yùn),mRNA穩(wěn)定及翻譯水平起重要調(diào)節(jié)作用。許多研究都提示FMRP通過對調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和蛋白質(zhì)的合成來影響突觸

4、的形成和功能。在樹突棘F(xiàn)MRP調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成,影響突觸發(fā)育和腦的可塑性。在突觸內(nèi),若FMRP缺乏,一些蛋白則過度翻譯,導(dǎo)致與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的長時(shí)程抑制的增強(qiáng)(LTP)。從而最終引起智力低下和行為問題。另診斷方面也均認(rèn)為檢測FMRP表達(dá)率比DNA檢測更能反映患者智力低下的水平?？傊瓼MRP的研究對Fra(X)的發(fā)病機(jī)制,臨床診斷及治療的研究至關(guān)重要。
　　 Hwu等研究發(fā)現(xiàn),FMR1基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)具有增強(qiáng)子活性的甲基化敏感

5、區(qū)(MSE),與FMR1基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。該MSE與cAMP反應(yīng)單位(CRE)堿基序列重疊,而CRE序列是環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(CREB)的結(jié)合位點(diǎn)。CREB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,具有調(diào)節(jié)包括記憶功能在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能,是長期記憶形成過程所必需的一種普遍存在的調(diào)節(jié)分子。另研究發(fā)現(xiàn) Fra(X)患者以及體外模型FMR1基因封閉后細(xì)胞內(nèi) cAMP水平均下降,且FMR1基因(CGG)n三核苷酸片段擴(kuò)增大小與 cAMP含量呈負(fù)相關(guān)

6、,隨著 FMR1的編碼蛋白——脆性X智力低下蛋白的表達(dá)增加,細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)量明顯增加。以上資料提示,FMR1基因、FMRP和cAMP二者之間可能存在相互調(diào)控關(guān)系。
　　 我們前期研究了 FMR1基因被甲基化封閉后對cAMP代謝過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶,即:腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)及磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)活性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FMR1基因封閉后細(xì)胞內(nèi)cAMP水平下降,在

7、FMR1基因封閉組腺苷酸環(huán)化酶活性明顯降低,而磷酸二酯酶的活性無顯著差異。由此,提出FMR1基因的功能缺陷可影響腺苷酸環(huán)化酶的活性,腺苷酸環(huán)化酶活性抑制可能是影響Fra(X)患者細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低的主要原因。假如采用藥物提高腺苷酸環(huán)化酶的活性,改善FMR1基因細(xì)胞內(nèi)cAMP的低水平狀態(tài),是否能誘導(dǎo)沉默F(xiàn)MR1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)呢?
　　 本研究試圖在被甲基化封閉的FMR1基因細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,探討特異性腺苷酸環(huán)化酶(AC)激

8、活劑-弗司可林(forskolin,FSK)誘導(dǎo)沉默F(xiàn)MR1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的可能性及其效果；并構(gòu)建FMR1啟動(dòng)子區(qū)MSE/CRE熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),為進(jìn)一步研究AC激動(dòng)劑重啟FMR1基因的機(jī)制,以及AC激動(dòng)劑活化CRE序列與啟動(dòng)子甲基化的關(guān)系奠定基礎(chǔ),可望為該病的治療提供新的思路和治療方法。
　　 研究方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):K-562及Hela細(xì)胞均用RPMI-1640完全培養(yǎng)液加10％的新生牛血清培養(yǎng),細(xì)胞

9、在溫度37℃和5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng),2—3天更換一次培養(yǎng)基。加硝普鈉后的細(xì)胞培養(yǎng)均避光培養(yǎng)。
　　 2、制作K-562細(xì)胞FMR1基因封閉的細(xì)胞模型:采用如下原理制造模型,即:硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)為經(jīng)典的一氧化氮(nitric oxide,NO)供體,通過可產(chǎn)生的NO活化DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA MeTase),使FMR1啟動(dòng)子區(qū)CpG島的MSE中的胞嘧啶發(fā)生高度甲基化,

10、從而阻斷了核酸因子與啟動(dòng)子的結(jié)合,抑制了FMR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　 2.1SNP濃度選取:應(yīng)用普通及 Taqman熒光定量PCR觀察FMR1基因的封閉效果,據(jù)文獻(xiàn)分為正常組、SNP500umol/L組、SNP800umol/L組、SNP1000umol/L組(分別加入對應(yīng)終濃度的SNP),培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞,據(jù)結(jié)果選取最佳濃度。
　　 2.2驗(yàn)證SNP在mRNA水平封閉FMR1基因的效果:同上應(yīng)用兩種PCR法觀察

11、FMR1基因的封閉效果,分別設(shè)6個(gè)時(shí)間點(diǎn){12h、24h、48h、72h、96h、96h(72h更換 SNP后)}觀察一次性加入SNP后封閉持續(xù)的時(shí)間,及換液后是否有持續(xù)封閉效果。
　　 2.3觀察SNP對蛋白水平FMRP表達(dá)的影響:應(yīng)用western blot方法,分別取3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)觀察FMRP的表達(dá)情況。
　　 3、觀察腺苷酸環(huán)化酶激活劑(FSK)對FMR1封閉基因mRNA水平重啟的效果:采用

12、SNP1000umol/L封閉基因,于培養(yǎng)24h后加入FSK(終濃度50μmol/L),分別于12h、24h、48h、72h收集細(xì)胞,并設(shè)正常對照組,應(yīng)用上述兩種PCR方法觀察FMR1基因的封閉后重啟效果。
　　 4、觀察腺苷酸環(huán)化酶激活劑(FSK)重啟 FMR1封閉基因后對 FMRP表達(dá)的影響:用western blot方法,于SNP1000umol/L于培養(yǎng)24h后加FSK(終濃度50μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)至72h之后收集細(xì)

13、胞,觀察FMRP的表達(dá)情況。
　　 5、熒光素酶載體的構(gòu)建
　　 5.1.FMR1基因啟動(dòng)子區(qū) MSE/CRE重疊片段的釣取:
　　 按takala質(zhì)粒提取試劑盒說明書常規(guī)提取基因組 DNA,用PCR法擴(kuò)增啟動(dòng)子片段。后將PCR產(chǎn)物與T載體相連,并提取質(zhì)粒T—MSE,測序驗(yàn)證。
　　 5.2表達(dá)載體構(gòu)建:
　　 以T—MSE為模板,應(yīng)用PCR法獲得帶有酶切位點(diǎn)kpnI和hindⅢ的野生啟動(dòng)子片段,

14、并提取質(zhì)粒,之后同 PGL-4載體質(zhì)粒一起用限制性內(nèi)切酶kpnI和hindⅢ進(jìn)行酶切,經(jīng)PCR、雙酶切及測序驗(yàn)證后,進(jìn)行連接構(gòu)建表達(dá)載體。
　　 6、熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)熒光素酶活性檢測
　　 6.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將對數(shù)生長期的hela細(xì)胞以105每孔的濃度鋪24孔板,根據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書配置轉(zhuǎn)染混合物(24孔板每孔量):PGL-4/MSE啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)?；騊GL-4 Basic5ul+

15、海腎質(zhì)粒0.5ul+lipo20003.5ul,并進(jìn)行共轉(zhuǎn),后繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 6.2相對熒光素酶活性檢測:
　　 收集上述細(xì)胞參照Dual—Luciferase Reporter Assay試劑盒說明測定熒光素酶活性。
　　 上述實(shí)驗(yàn)均相同條件下,重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,除FMRP表達(dá)量的數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)±極差(M±R

16、)表示外,其他數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示；熒光定量PCR結(jié)果的采用2-ΔΔCT值分析,除SNP時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)不符合方差齊性組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal—Wallis test,多重比較采用 Bonferroni法外,其他均采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的 One—Way ANOVA,多重比較采用 SLD法； Western blot數(shù)據(jù)是采用Bia-Rad軟件分析得的 Density ratio,即A值分析,

17、由于不符正態(tài)分布,組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal—Wallis test,多重比較采用Bonferroni法；相對熒光素酶活性檢測數(shù)據(jù)應(yīng)用相對熒光素酶活性強(qiáng)度值分析,組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；以上均取P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、成功制作K-562細(xì)胞FMR1基因封閉的細(xì)胞模型
　　 1.1 SNP在500、800、1000μmol/L濃度時(shí),均有一定

18、封閉效果(F=105.423,P<0.001),其FMR1基因的表達(dá)量分別下降到處理前的0.063、0.017、0.006倍,可見 SNP1000μmol/L時(shí)封閉效果最明顯(P<0.001),且一次加入封閉效果可持續(xù)到96H,于72h換液繼續(xù)培養(yǎng)后可達(dá)持續(xù)封閉效果。
　　 1.2 SNP封閉FMR1基因后對蛋白水平FMRP表達(dá)的影響:SNP封閉FMR124h,48h,72h后,FMRP的表達(dá)量依次下降,提示SNP封閉FMR1基

19、因后可使FMRP的表達(dá)明顯受抑(H=12.833,P=0.012)。
　　 2、FSK對FMR1封閉基因 mRNA水平重啟的效果:
　　 FSK可于24H時(shí)(F=34.921,P<0.001；P<0.001)重啟封閉后的FMR1基因,使其表達(dá)量升至對照組的0.133倍,并持續(xù)到48H(F=34.921,P<0.001；P<0.001),此時(shí)其表達(dá)量是對照組的0.138倍。
　　 3、FSK重啟 FMR1封閉基因后

20、對FMRP表達(dá)的影響:FSK可使表達(dá)明顯受抑的FMRP重新表達(dá)(H=12.833,P=0.012；P=1.00),72h后FMRP的表達(dá)量幾乎與對照組相當(dāng)。
　　 4、熒光素酶載體構(gòu)建:步驟中所有序列(MSE序列、加酶切位點(diǎn)后的MSE序列)測序正確,構(gòu)建成功的載體經(jīng)初步鑒定、PCR法、雙酶切法及測序驗(yàn)證均成功。
　　 5、熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)熒光素酶活性檢測:
　　 PGL-4/MSE質(zhì)粒與海腎質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hela

21、細(xì)胞后,所測得熒光素酶活性強(qiáng)度值分析,與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,顯示質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入hela細(xì)胞。表明以MSE/CRE重疊序列為研究對象的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)構(gòu)建成功。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.成功制作了K-562細(xì)胞FMR1基因封閉的細(xì)胞模型,可使封閉后FMR1基因最低表達(dá)量降至處理前的0.006倍,FMRP的表達(dá)量降至處理前0.477倍,驗(yàn)證了此方法制造 Fra(X)細(xì)胞模型的可行性。
　　 2.證

22、實(shí)FSK可在mRNA水平重啟甲基化封閉的FMR1基因,其基因表達(dá)量可達(dá)對照組的0.138倍,且可持續(xù)到48小時(shí)；發(fā)現(xiàn)用藥72小時(shí)后FMRP蛋白表達(dá)量可接近正常組水平；提示特異性腺苷酸環(huán)化酶激活劑可有效地誘導(dǎo)甲基化封閉的FMR1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),可望為Fra(X)的治療提供新的思路和治療前景。
　　 3.成功構(gòu)建了MSE/CRE重疊序列/PGL-4雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),為進(jìn)一步研究AC激動(dòng)劑重啟FMR1基因的機(jī)制,以及AC激動(dòng)