基于肽段N端或組氨酸結(jié)合反應(yīng)的蛋白質(zhì)混合物簡(jiǎn)化策略.pdf

1、復(fù)雜生物體系中的蛋白質(zhì)以及因不同修飾而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的數(shù)量可達(dá)百萬(wàn)種。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入進(jìn)展，這些動(dòng)態(tài)范圍過(guò)寬、理化性能差異過(guò)大的復(fù)雜蛋白質(zhì)為探索生命活動(dòng)的本質(zhì)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。高豐度蛋白質(zhì)因其表達(dá)水平高而容易被有效分離鑒定，與此相比中低豐度蛋白質(zhì)由于本身數(shù)量龐大，組成復(fù)雜而不易被有效檢測(cè)，在分離和鑒定過(guò)程中，高豐度蛋白質(zhì)的強(qiáng)信號(hào)也會(huì)掩蓋或結(jié)合大量的低豐度蛋白質(zhì)，為中低豐度蛋白質(zhì)的分離鑒定造成極大干擾。不僅是低豐度蛋白質(zhì)，對(duì)于很

2、多高豐度蛋白質(zhì)的研究，同樣面臨質(zhì)譜分析結(jié)果的序列覆蓋率低，定量穩(wěn)定性差等問(wèn)題，這給蛋白質(zhì)組研究中的分析鑒定方法學(xué)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。針對(duì)此問(wèn)題，科研人員從不同的角度入手提出解決方案。
　　在蛋白質(zhì)組的研究中，鳥(niǎo)槍法被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)。蛋白質(zhì)混合物被酶解為肽段的混合物，然后利用質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)序分析，計(jì)算機(jī)根據(jù)科研人員已經(jīng)設(shè)定的計(jì)算法則，將實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖匹配，并找到鑒定肽段在蛋白質(zhì)序列中的相應(yīng)位置，從而確定該混合物中具體的蛋白質(zhì)成

3、分。鳥(niǎo)槍法的應(yīng)用擺脫了傳統(tǒng)凝膠分離技術(shù)中的限制與不足，同時(shí)也帶來(lái)了相應(yīng)的弊端。
　　通過(guò)鳥(niǎo)槍法，混合溶液中不僅產(chǎn)生了易于質(zhì)譜檢測(cè)的高豐度肽段，也產(chǎn)生了難以檢測(cè)到的低豐度肽段。所謂低豐度，并不意味著這些肽段含量非常低，它們可能僅僅是被數(shù)量巨大的高豐度肽段抑制，或者在質(zhì)譜分析時(shí)，離子化效率偏低，由于質(zhì)譜靈敏度的限制，在圖譜采集時(shí)更容易被遺漏掉。但是，即便是因?yàn)楦鞣N原因，部分肽段的序列及其翻譯后修飾變體，無(wú)法有效監(jiān)測(cè)，并不意味著這些序列

4、攜帶的信息不重要。相反，我們要發(fā)展相應(yīng)的技術(shù)體系與方法，幫助發(fā)現(xiàn)這些遺漏的肽段或蛋白質(zhì)。
　　大量的研究結(jié)果表明，低豐度肽段、蛋白質(zhì)，在生物界中往往攜帶著重要的信息或是發(fā)揮著不可取代的作用。經(jīng)過(guò)多年來(lái)的研究表明，在疾病治療方面，低豐度肽段或是蛋白質(zhì)往往充當(dāng)了診斷、預(yù)后和治療效果的標(biāo)記物，同時(shí)它們也可能是治療的靶點(diǎn)。因此，對(duì)于高豐度蛋白質(zhì)去除和低豐度蛋白質(zhì)的富集、鑒定成為了具有重要意義的研究方向。
　　要改善低豐度蛋白質(zhì)的鑒定

5、，一般通過(guò)三種機(jī)制：(1)消耗高豐度蛋白質(zhì)；(2)富集低豐度蛋白質(zhì)；(3)提高質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)的靈敏度與準(zhǔn)確度。其中提高色譜、質(zhì)譜的分離與分辨率成本高，且容易受到儀器本身的條件限制，因此，目前國(guó)際上對(duì)于中低豐度的分離與鑒定主要在富集低豐度蛋白質(zhì)方面，例如抗體免疫去除；蛋白均衡器；修飾蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)富集等，但是這些方法具有選擇性，對(duì)于復(fù)雜樣本的通用性較差?，F(xiàn)在的問(wèn)題是，我們?nèi)狈νㄓ眯院玫牡鞍踪|(zhì)復(fù)雜體系簡(jiǎn)化策略，因此該研究課題從兩個(gè)方面

6、展開(kāi)：第一，利用氨基活性反應(yīng)基團(tuán)或羧基活性反應(yīng)基團(tuán)與化學(xué)基團(tuán)的無(wú)差別反應(yīng)，達(dá)到復(fù)雜系統(tǒng)中高豐度蛋白質(zhì)或肽段的消減；第二，靶向富集含某種特定氨基酸的肽段，從而簡(jiǎn)化體系，降低基質(zhì)效應(yīng)。
　　本論文共分為三個(gè)部分，第一章概述了蛋白質(zhì)組研究中低豐度蛋白質(zhì)的富集、鑒定技術(shù)，以及靶向富集含特定氨基酸肽段的意義、現(xiàn)狀與研究進(jìn)展，同時(shí)對(duì)目前國(guó)際上低豐度研究的常用方法，例如抗體免疫去除、蛋白均衡器、修飾蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合等進(jìn)行了分析研究，在此基礎(chǔ)上提

7、出了本論文的研究?jī)?nèi)容與目標(biāo)，即通用性強(qiáng)的高豐度蛋白質(zhì)去除方法以及特異性肽段富集策略。
　　在第二章，我們開(kāi)展了通用性強(qiáng)的高豐度蛋白質(zhì)去除方法的探究。在這一部分中，我們利用酶切后肽段末端氨基活性反應(yīng)基團(tuán)或羧基活性反應(yīng)基團(tuán)與活性試劑發(fā)生結(jié)合作用從而去除高豐度肽段，并進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)合氨基或羧基的濃度速率關(guān)系實(shí)現(xiàn)研究目的。
　　首先是對(duì)該實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)部分進(jìn)行研究，我們考察了模型生物酵母細(xì)胞三種常用的不同方法，對(duì)比了它們的提取效率，提取方

8、法的重復(fù)性考察，不同提取方法得到酵母蛋白質(zhì)的豐度與其相對(duì)譜圖數(shù)的線(xiàn)性關(guān)系的考察，可鑒定到的蛋白質(zhì)豐富范圍與理論值的比較。經(jīng)過(guò)該部分實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)雖然NETN超聲破碎法的提取效率最高，但經(jīng)過(guò)FASP酶切處理，質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示SDS堿裂解法與Urea超聲破碎法鑒定到了蛋白質(zhì)數(shù)量更多，其中SDS堿裂解法對(duì)肽段的修飾作用明顯，因此Urea超聲破碎法是理想的提取方法。
　　在第二部分的研究中，我采用Urea超聲破碎法進(jìn)行酵母蛋白質(zhì)提取。通

9、過(guò)調(diào)研對(duì)比其他活性試劑，我選用了通用性強(qiáng)的CNBr活化瓊脂糖珠作為肽段氨基端反應(yīng)試劑，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)多次結(jié)合后，部分肽段有損失，但是高豐度與低豐度之間拉平作用明顯。
　　在第三章中，由于隨著高通量蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的發(fā)展，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜被廣泛的運(yùn)用于深度地鑒定并定量分析目標(biāo)肽段和蛋白質(zhì)。但由于峰容量限制、基質(zhì)效應(yīng)等問(wèn)題，在液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析中，只能獲得有效的蛋白質(zhì)序列覆蓋度，大量隱含肽段、色譜分離時(shí)的共洗脫肽

10、段，嚴(yán)重影響以二級(jí)質(zhì)譜為核心的定量方法的準(zhǔn)確度。為了簡(jiǎn)化分析體系，提高質(zhì)譜定量分析的準(zhǔn)確度，本研究對(duì)含組氨酸肽段開(kāi)展選擇性富集方法的探索，建立組氨酸肽段與定量蛋白質(zhì)組研究串聯(lián)的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cu-beads與肽段反應(yīng)30mins,肽段上樣量與Cu-beads比例為1：1（μg:ul）的情況下為最優(yōu)條件，可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高的his肽段選擇性富集。在iTRAQ按比例標(biāo)記試驗(yàn)中，含組氨酸肽段富集可以明顯改善定量分析的準(zhǔn)確度。