蟲草多糖的仿生合成及結(jié)構(gòu)與活性研究.pdf

1、冬蟲夏草( Cordyceps sinensis)是中國傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥材,作為傳統(tǒng)中藥,效果顯著,近來,由于幾近枯竭的野生資源和昂貴的價(jià)格,人們把目光投向了如何人工大規(guī)模培育冬蟲夏草,于是,市面上出現(xiàn)了人工蟲草菌粉。然而,作為蟲草中最重要的藥物組分之一的多糖,其特殊結(jié)構(gòu)和功能卻難以在人工培育蟲草中重現(xiàn)?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn),某些負(fù)責(zé)特定修飾多糖的酶的表達(dá)可能需要特定誘導(dǎo)劑能表達(dá)和發(fā)揮作用,比如滲透壓,溫度等等。動物多糖生物合成是基因的集合的一個(gè)過

2、程,是一系列化學(xué)酶催化反應(yīng)的集合,即動態(tài)響應(yīng)關(guān)鍵的環(huán)境變化來組裝具有特定功能的特定多糖結(jié)構(gòu)。在真菌中也可能是這種情況:真菌中多糖的合成也是一些列化學(xué)生物反應(yīng)的的產(chǎn)物,也是環(huán)境影響甚至決定生物合成能。已有報(bào)道稱,在不同的培養(yǎng)環(huán)境中,真菌表達(dá)非常不同的基因組。
　　論文對三種來源的天然冬蟲夏草進(jìn)行“蟲”和“草”分離,然后對其和一種僵蠶用五種方法進(jìn)行多糖的提取,并用 DEAE純化粗多糖,接著對得到的多糖進(jìn)行基本理化性質(zhì)(包括總糖含量、蛋

3、白含量、紅外光譜、元素分析、分子量、醋酸纖維素電泳和單糖組成分析)。同時(shí)對三種蟲草菌(蛹蟲草11Y、蝙蝠蛾擬青霉、中華被毛孢)在不同金屬鹽離子(硫酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂)、不同濃度(8個(gè))和不同種類鹽(硫酸鈉和氯化鈉)的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),對培養(yǎng)物進(jìn)行三步提取得到粗多糖產(chǎn)物,并用陰離子交換樹脂進(jìn)行粗多糖的分離純化,接著同天然蟲草多糖一樣進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析。論文對得到的天然和人工蟲草多糖進(jìn)行4種人癌細(xì)胞(H1299、A549、HCT116和H

4、T29)毒性測試、以 BaF3 FR1c細(xì)胞為基礎(chǔ)的模型系統(tǒng)檢測對 FGF/FGFR信號的影響和抗血管生成活性,并探討了蟲草多糖的抗血管生成活性機(jī)理。論文新開發(fā)的三種技術(shù)(穩(wěn)定34S-硫酸鹽的同位素標(biāo)記技術(shù)、苯胺和 D5-苯胺標(biāo)記技術(shù)和穩(wěn)定同位素還原糖醛酸)并聯(lián)用 LC-MS分析技術(shù),結(jié)合甲基化實(shí)驗(yàn)和 NMR對天然和人工蟲草多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
　　結(jié)論:論文得到了天然蟲草粗多糖28種,天然蟲草純化多糖18種,人工蟲草粗多糖72種,

5、人工蟲草純化多糖46種,基本理化性質(zhì)顯示不同提取方法得到的天然和人工蟲草多糖具有不同的分子量、總糖和蛋白含量,醋酸纖維素電泳分析顯示蟲草多糖中可能有酸性多糖,元素分析結(jié)果則認(rèn)為蟲草多糖中有硫酸根,天然和人工蟲草多糖的單糖都主要含有三種中性糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖),但每種單糖的比例在樣品中各不相同。
　　論文對得到的164種多糖進(jìn)行癌細(xì)胞毒性檢測,發(fā)現(xiàn)只有7種多糖呈現(xiàn)30~40％的細(xì)胞毒活性;以 BaF3 FR1c細(xì)胞為基礎(chǔ)的模

6、型系統(tǒng)檢測天然和人工蟲草多糖對 FGF/ FGFR信號的影響,其中15種多糖能刺激 FGF/FGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,且人工蟲草多糖遠(yuǎn)沒有天然蟲草多糖的活性好,不同產(chǎn)地的冬蟲夏草活性不同,且并不是所有產(chǎn)地的天然冬蟲夏草都有刺激 FGF/FGFR的活性,天然蟲草有活性的組分集中在堿提和酶提產(chǎn)物中,且來源于“草”的多糖比來源于“蟲”的活性稍高;通過向蛹蟲草菌株生長的培養(yǎng)基中添加硫酸鈉或氯化鈉,我們觀察到人工培養(yǎng)得到的純化多糖的有鹽度誘導(dǎo)的抗血管

7、生成活性,機(jī)理是通過降低 VEGF單聚體和二聚體的表達(dá),抑制 HUVEC的遷移來實(shí)現(xiàn)抗血管生成活性的。
　　論文新開發(fā)的三種技術(shù):穩(wěn)定34S-硫酸鹽的同位素標(biāo)記技術(shù)、苯胺和D5-苯胺標(biāo)記技術(shù)和穩(wěn)定同位素還原糖醛酸技術(shù),這些技術(shù)聯(lián)用 LC-MS分析,結(jié)合甲基化實(shí)驗(yàn)和 NMR,對天然和人工蟲草多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了闡述:13CNMR發(fā)現(xiàn)了 WY8-2中糖醛酸、甲基化糖、乙酰化糖的存在;對蛹蟲草11Y用34S進(jìn)行培養(yǎng),并用同位素的方法第一次證

8、明了真菌中共價(jià)硫酸根的存在;第一次采用同位素還原并用 LC-MS的技術(shù)手段,在蟲草多糖中發(fā)現(xiàn)聚半乳聚糖、甲基化和乙?；肴榫厶堑拇嬖?苯胺和 D5-苯胺標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)所有蟲草多糖中都含有糖醛酸和硫酸多糖,不同菌株來源的人工蟲草多糖之間的寡糖比例不同,同種菌株來源的人多蟲草多糖不同條件下得到的寡糖比例也不同,11Y菌株在高鹽環(huán)境中得到的多糖組分中含有的酸性多糖多;能夠刺激 FGF/FGFR的天然蟲草多糖中都含有較多的酸性組分(糖醛酸或硫酸根