硫嘌呤類藥物安全性監(jiān)測體系的建立.pdf

1、抗代謝藥：硫鳥嘌呤(6-thioguanine,6-TG)，6-巰基嘌呤（6-mercaptopurine,6-MP)及硫唑嘌呤(Azathioprine,AZA)均為嘌呤拮抗劑，這類藥物通過干擾嘌呤代謝的所有環(huán)節(jié)，抑制嘌呤核苷酸的合成，進而抑制細胞DNA、RNA及蛋白質的合成。在臨床上，硫嘌呤類藥物除用于治療急性白血病外，主要作為免疫抑制劑廣泛用于器官移植以及自身免疫疾病的治療。但是此類藥物的治療存在很大的個體差異。藥物個體療效的不確

2、定性和對于藥物嚴重毒副作用的顧慮都限制了硫嘌呤類藥物在患者中的使用，主要原因是臨床缺乏相應的預測方法，這一矛盾在國內尤為突出。
　　 目前，臨床上通過定期監(jiān)測服用硫嘌呤類藥物患者的血象來指導其合理用藥。研究發(fā)現藥物活性物質的水平和降低的紅細胞計數、降低的血小板計數、降低的白細胞計數、降低的中性粒細胞計數呈正相關[1]。因此定期進行常規(guī)的血細胞計數有助于診斷此類藥物的血液毒性，但是常規(guī)的血象監(jiān)測難以預測毒性的危險性，通常在血細胞計

3、數發(fā)生改變之前,骨髓已受到一定損害，在血常規(guī)改變之后，骨髓的造血功能已受嚴重影響，血中藥物活性物質濃度已高出正常治療濃度[2]，導致硫嘌呤類藥物不良反應增多，甚至造成嚴重的醫(yī)療事故。眾多研究表明，硫嘌呤類藥物治療的個體差異與其代謝途徑密不可分。這類藥物本身均無生物活性，必須經過體內一系列的酶代謝途徑，最終生成有活性的6-硫代鳥嘌呤核苷酸(6-thioguanine nucleotides,6-TGNs)產生細胞毒效應而發(fā)揮療效，但其亦是

4、骨髓抑制的主要原因。6-TGNs在體內的濃度決定了此類藥物的有效性和毒性。而巰嘌呤甲基轉移酶(thiopurine methyltransferase,TPMT)作為硫嘌呤類藥物代謝途徑中重要的代謝酶，競爭性抑制6-TGNs的生成，進而影響藥物的療效及毒副作用。臨床研究表明，TPMT 活性在不同個體之間有很大的差異。如果患者TPMT 活性較低或遺傳有TPMT 缺陷,即使給予常規(guī)劑量的藥物，也會生成過多有活性的6-TGNs,大大增加了骨髓

5、抑制的風險[3,4]，另一方面，具有TPMT 高活性的患者，在常規(guī)劑量下卻很難達到治療效果，而且過多的甲基化產物的生成可能導致肝臟毒性的發(fā)生[5,6]。
　　 TPMT基因多態(tài)性是造成TPMT 酶活性個體差異的主要原因，目前對于中國漢族健康人群的TPMT 活性分布及基因多態(tài)性分布情況已見報道，漢族健康人群的TPMT 活性呈正態(tài)分布，且TPMT*3C為最主要的突變等位基因[7]。TPMT基因突變導致TPMT 活性降低[8]，TPM

6、T 野生純合子對應TPMT 高活性，TPMT*3C 突變基因雜合個體顯示TPMT中等活性，而突變純合子對應TPMT 活性缺乏。鑒于以上情況，本研究對收集的114例自身免疫疾病患者進行了TPMT*3C的篩選和TPMT 酶活性的檢測，以期建立硫嘌呤類藥物安全性監(jiān)測體系，為臨床提供個體化用藥依據。
　　 1.建立引物特異性TaqMan 聚合酶鏈反應檢測TPMT*3C 突變1.1標本來源114例自身免疫疾病患者，包括39例類風濕性關節(jié)炎

7、，33例白塞綜合癥，22例干燥綜合癥，20例間質性肺炎。所入選的患者均為漢族人，性別、身高、體重不限，年齡范圍3 —68，性別男性87例，女性27例。以直接調查方式獲得相關資料，包括：年齡、性別、體重、民族、合并藥物以及不良反應等。
　　 2.建立高效液相色譜法（HPLC）測定TPMT 活性
　　 3種濃度的6-MMP 標準溶液10μl （使孵化反應后0.5ml 反應液中6-MMP的濃度分別為140，112，35μg/L

8、），再按上述血標本處理方法操作（不加入底物6-MP）并進行分析，求得6-MMP在紅細胞裂解液中的回收率。在同一天內和不同天間對以上3個濃度的6-MMP 標準紅細胞裂解液樣品重復處理5 批（不加入底物6-MP），并進樣分析，求日內和日間RSD。
　　 結論：
　　 （1）本研究所建立的引物特異性TaqMan 聚合酶鏈反應（PS-TaqMan PCR）法用于檢測TPMT*3C 突變。該方法可靠、高通量且效率高，與傳統(tǒng)的聚合酶

9、鏈反應—限制性片段長度多態(tài)性(PCR —RFLP)法相比，省去了繁瑣的操作，更簡便、準確，更適合大規(guī)模的臨床樣本分析。
　　 （2）對已經服用硫嘌呤類藥物的患者，因此類藥物自身的干擾影響TPMT 活性測定的結果，建議通過檢測TPMT*3C的突變?yōu)榕R床用藥提供依據。
　　 （3）由于篩查出的TPMT*3C基因突變例數太少，在本研究中還不能得出TPMT*3C突變雜合子TPMT平均活性明顯低于野生型TPMT基因（TPMT*1）

10、純合子的TPMT平均活性。因此還有待于大樣本的進一步研究。
　　 （4）對未服用硫嘌呤類藥物的患者，因TPMT 活性能較好的預測早期藥物毒副作用的發(fā)生及治療療效，指導藥物治療劑量，建議通過測定TPMT的活性為臨床個體化給藥提供依據。
　　 （5）本實驗所建立的HPLC 用甲硝唑做內標測定紅細胞裂解液中6-MMP濃度,兩者分離較好，且紅細胞裂解液中的內源性雜質不干擾6-MMP的測定。6-MMP在14～224μg/L內具有良