HMGB1刺激下與RAGE胞內段相互作用蛋白的鑒定.pdf

1、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是高遷移率族(HMG)蛋白家族成員之一,1973年英國科學家Goodwin在牛胸腺細胞中首次發(fā)現(xiàn),因其在聚丙烯酰胺電泳中的高遷移率得名,它是一種含量豐富、分子量小、高度保守的染色質相關非組蛋白。HMGB1分布十分廣泛,多種器官細胞(如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等)中均有表達,并位于大多數(shù)細胞的胞核和胞漿中。最初發(fā)現(xiàn)其作為DNA結合蛋白穩(wěn)定染色質的結構和功能,調節(jié)基因轉錄。近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其具有豐富的生

2、物學功能,包括參與腦的發(fā)育和神經細胞生長、纖維蛋白溶酶原的活化、腫瘤細胞轉移、免疫細胞分化,廣泛參與全身的炎癥反應和組織損傷以及動脈粥樣硬化(AS)。
　　 動脈粥樣硬化是西方發(fā)達國家的主要死亡原因。中國,近年來,隨著飲食結構的變化、運動的缺乏和生活工作壓力的增大,我國心血管疾病發(fā)病率、死亡率均呈上升之勢,已成為危害民眾生命的“第一殺手”,全國每年因冠心病死亡的患者達110萬人。1999年,Ross教授明確提出“動脈粥樣硬化是一

3、種炎癥性疾病”。AS具有慢性炎癥的病理過程,其發(fā)生發(fā)展過程中始終伴隨著炎癥反應。HMGB1在動脈粥樣硬化中的研究尚處于起步階段,目前尚無系統(tǒng)的報道。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1在人AS病變部位明顯增高,而且與巨噬細胞浸潤明顯相關。同時壞死的細胞也可以釋放大量的HMGB1。HMGB1可以和RAGE結合激活炎癥相關信號通路,造成巨噬細胞聚集,形成正反饋環(huán)路,促進AS病變發(fā)展。近來研究發(fā)現(xiàn):血清中HMGB1水平的增高和冠心病(CAD)之間呈正相關。多

4、變量逐步邏輯回歸分析:HMGB1和內源性分泌型糖基化終末產物受體(esRAGE)是CAD的獨立危險因素。動脈粥樣硬化相關炎癥指標C反應蛋白(CRP)可以以劑量依賴的方式通過p38MAPK通路促進HMGB1的產生,HMGB1又可以促進炎癥因子的產生,從而促進血管壁的慢性炎癥。這些結果都支持HMGB1參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。而且巨噬細胞扮演重要的角色。
　　 RAGE是一種模式識別受體,是免疫球蛋白超家族的成員。RAGE和配體

5、的結合通過細胞內的信號轉導途徑激活下游的細胞信號:反應性氧自由基(ROS)、小GTP酶Ras、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核轉錄因子-κB(NF-κB)等信號分子引起一系列的病理反應,造成前炎癥細胞的募集。在動脈粥樣硬化部位激活的內皮細胞,血管平滑肌細胞,巨噬細胞中RAGE的表達都上調。通過和配體的結合產生大量的促炎因子和細胞粘附分子。而且,RAGE可以募集白細胞到動脈硬化的內膜。通過RAGE的激活造成內皮功能障礙,白細胞浸潤,氧化

6、應激,血管炎癥。這些都依賴于RAGE介導的信號通路和基因的表達。RAGE和配體的相互作用在心血管病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。可溶性的RAGE可以競爭性的抑制RAGE配體與RAGE的結合,減輕動脈硬化的發(fā)展,最近研究表明:CAD患者血清中esRAGE水平下降和CAD相關。并且,esRAGE的水平和病變的冠狀動脈數(shù)目負相關?？梢妰仍葱缘谋Ｗo因子的減少和危險因素一樣在糖尿病冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)展中扮演重要的角色。所以RAGE可能是治療動脈

7、硬化的新靶點。
　　 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是糖尿病患者常見的并發(fā)癥和主要的死因,因此探討糖尿病冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)病機制具有重要的意義。我們提出假說:在細胞外環(huán)境中的HMGB1分子可以作為旁分泌或自分泌因子通過和受體,主要是RAGE結合,引起重要信號通路的激活,活化單核細胞,造成單核細胞遷移到動脈硬化的血管內膜,遷入內皮下間隙的單核細胞被激活并分化成巨噬細胞。OX-LDL、OX-Lp(a)可與巨噬細胞表面的清道夫受體結合而被

8、攝取,泡沫細胞形成,加速動脈粥樣硬化斑塊的形成。我們實驗室側重細胞信號轉導方面的研究,因此我們十分關心RAGE下游的細胞信號轉導通路。
　　 但是RAGE受到刺激后首先和哪種蛋白結合,如何將細胞外信號傳導至上述信號分子,目前尚無明確報道。RAGE胞內段由41個富含負電荷的氨基酸組成,該段很可能在配體結合受體后,將信號傳遞給下游分子,產生細胞效應。RAGE對下游信號分子的激活依賴其胞內段結合的哪些蛋白?這個問題對闡明RAGE下游信

9、號轉導具有重要意義。因此鑒定RAGE胞內段結合的蛋白可以為進一步認識RAGE的下游細胞信號轉導通路奠定堅實基礎。
　　 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在細胞內特定條件下相互作用的有效方法。其原理是:當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質一蛋白質間的相互作用被保留了下來。
　　 在本研究中我們選擇免疫共沉淀的方法獲得在HMGB1刺激下與目

10、的蛋白RAGE相互作用蛋白質復合體,運用經典的實驗策略經SDS-PAGE凝膠電泳進行分離。隨后用質譜鑒定復合體中的組成成分。
　　 總之,我們通過免疫共沉淀技術,得到了在HMGB1刺激小鼠單核巨噬細胞后與RAGE胞內段相互作用的蛋白,使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復合體并進行差異蛋白條帶的分析,挖取差異蛋白條帶進行MALDI FOF/TOF質譜鑒定。本研究取得如下結果:
　　 1.純化得到了His-HMGB1融合蛋

11、白。
　　 2.通過Western blot檢測HMGB1刺激Raw264.7細胞不同時間點后MAPK信號通路的激活情況,選取了合適的刺激濃度和刺激時間點。
　　 3.免疫共沉淀得到了誘餌蛋白RAGE的富集。
　　 4.經SDS—PAGE凝膠電泳分離蛋白復合體后分析差異蛋白條帶,選取差異蛋白條帶進行質譜鑒定,得到與RAGE相互作用的候選蛋白actin。
　　 5.鑒定出在HMGB1刺激下與RAGE細胞內段

12、相互作用的蛋白-SLP76。
　　 6.明確RAGE與actin相互作用隨HMGB1刺激時間變化的趨勢。
　　 7.明確RAGE與SLP76相互作用隨HMGB1刺激時間變化的趨勢。
　　 綜上所述,本研究采用免疫共沉淀技術鑒定在HMGB1刺激下與RAGE的相互作用蛋白質,發(fā)現(xiàn)了潛在的和RAGE的相互作用蛋白actin和SLP76,為進一步研究RAGE蛋白信號通路的分子機制打下了良好的基礎。并為認識HMGB1在動脈