肝細(xì)胞分泌的HMGB1蛋白的分離、純化、鑒定及對小鼠巨噬細(xì)胞的作用.pdf

1、目的:(1)分離、純化肝細(xì)胞系HepG2細(xì)胞分泌的高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1),并加以鑒定。
　　(2)探討HMGB1在體外對巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖、釋放乳酸脫氫酶(1actate Dehydrogenase,LDH)、凋亡以及分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1βp(interleukin-1 b

2、eta,IL-1β)和白介素-6(IL-6)的作用。
　　方法:(1)分別培養(yǎng)人肝細(xì)胞系HepG2細(xì)胞與免疫細(xì)胞系U937細(xì)胞,采用400ng/mL的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激20 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清。依次采用超濾濃縮、陽離子交換層析(CM-Sepharose cation exchange chromatography)、陰離子交換層(DEAE-Sepharose cation exchang

3、e chromatography)、Sephadex G75凝膠過濾層析(Sephadex G75-gel filtration chromatography),結(jié)合免疫沉淀的方法,進(jìn)行分離純化。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及western印跡法進(jìn)行蛋白分子質(zhì)量及性質(zhì)鑒定。(2)體外經(jīng)不同濃度的HMGB1(10,50,100ng/mL)刺激24 h,并以100ng/mL于不同時(shí)間點(diǎn)(8 h,24 h,48 h)刺激巨噬細(xì)胞

4、RAW264.7,采用MMT法檢測巨噬細(xì)胞的增殖,收集培養(yǎng)上清,測定上清中的LDH含量。(3)體外經(jīng)不同濃度的HMGB1(10,50,100ng/mL)刺激24 h,或以100ng/mL的HMGB1作用不同時(shí)間(8 h,24 h,48 h)后,采用TUNEL法檢測巨噬細(xì)胞凋亡的情況。(4)體外經(jīng)不同濃度的HMGB1(10,50,100ng/mL)刺激24 h,或以100ng/mL作用不同時(shí)間(8 h,24 h,48 h),采用酶聯(lián)免疫吸

5、附法(ELISA)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β以及IL-6水平的變化。
　　結(jié)果:(1)從2株細(xì)胞培養(yǎng)上清分離純化得到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定,其純度達(dá)90％以上,分子質(zhì)量約為26 kD,Western印跡法鑒定為HMGB1蛋白。(2)MTT結(jié)果顯示,HMGB1不同劑量(10,50,100ng/mL)組以及100ng/mLHMGB1作用不同時(shí)間點(diǎn)(8 h,24 h,48 h),巨噬細(xì)胞的增殖能力均明顯低于巨噬細(xì)胞

6、空白對照組(P＜0.05)。(3)LDH檢測結(jié)果顯示,HMGB1不同劑量(10,50,100ng/mL)組以及100ng/mLHMGBl作用不同時(shí)間點(diǎn)(8 h,24 h,48 h),巨噬細(xì)胞釋放LDH的量均明顯高于巨噬細(xì)胞空白對照組(P＜0.05)。(4)經(jīng)不同濃度的HMGB1刺激24 h,其中100ng/mL組HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡效應(yīng)最強(qiáng),與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。100ng/mL的HMGB1作用巨噬細(xì)胞不同時(shí)間

7、后,以48 h組凋亡率發(fā)生最高,明顯高于對照組(P＜0.05)。(5)經(jīng)不同濃度的HMGB1刺激24 h,可促進(jìn)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)增強(qiáng),與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01),其中HMGB1劑量為100ng/mL時(shí)作用最強(qiáng),呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。采用100ng/mL的HMGB1作用不同時(shí)間后,培養(yǎng)上清液中TNF-α,IL-1β和IL-6的表達(dá)水平在48 h達(dá)高峰(P＜0.01),呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論