人CD34+造血干-祖細(xì)胞和日本血吸蟲的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本論文在楊芃原教授和韓澤廣研究員的指導(dǎo)下進(jìn)行，主要工作在國(guó)家人類基因組南方研究中心完成。 本博士論文的主要貢獻(xiàn)為：1.對(duì)人CD34+造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，鑒定了370個(gè)蛋白質(zhì)，這是迄今為止鑒定最多的CD34+細(xì)胞蛋白，并且鑒定了各種轉(zhuǎn)錄組研究沒(méi)能發(fā)現(xiàn)的133個(gè)CD34+細(xì)胞蛋白，發(fā)現(xiàn)了CD34+細(xì)胞具有可塑性的新的證據(jù)，證明了反義核酸未能完全阻止其相應(yīng)基因的表達(dá)，并提出一些蛋白的異質(zhì)性是由于翻譯后修飾造成

2、；2.對(duì)日本血吸蟲進(jìn)行了大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，得到了大量的重要發(fā)現(xiàn)。獲得了約15000個(gè)基因種類，約占日本血吸蟲基因總數(shù)的90﹪，其中包括8400多個(gè)血吸蟲基因編碼蛋白質(zhì)，建立了目前世界上最大的日本血吸蟲功能基因組公共數(shù)據(jù)庫(kù)、基因克隆庫(kù)和菌種庫(kù)；鑒定了3260個(gè)不同生活周期的以及表皮的血吸蟲蛋白，并首次鑒定了卵殼蛋白，提供了眾多藥物靶點(diǎn)和潛在疫苗的選擇；在血吸蟲基因中發(fā)現(xiàn)了大量的遺傳多態(tài)性位點(diǎn)，并用序列測(cè)定和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)驗(yàn)證；

3、分析得到了血吸蟲保守的和特異的蛋白，為認(rèn)識(shí)血吸蟲生物學(xué)特征、開發(fā)抗血吸蟲藥物以及研制血吸蟲疫苗奠定了理論基礎(chǔ)；3.鑒定并分析了純化后的日本血吸蟲樣品中的63個(gè)宿主蛋白，并用免疫組化驗(yàn)證。這是首次發(fā)現(xiàn)如此多的宿主蛋白可能與血吸蟲密切相互作用。這些宿主蛋白與宿主在血吸蟲感染時(shí)的免疫反應(yīng)、成蟲的免疫逃避和肉芽腫的形成有關(guān)，從而豐富了宿主-寄生蟲的相互作用方面的信息。 本論文工作包括三個(gè)部分：1.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的建立與完善，為后續(xù)

4、研究工作奠定了基礎(chǔ)；2.人CD34+造血干/祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，3.日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄組/蛋白質(zhì)組學(xué)研究。其中造血干細(xì)胞研究和日本血吸蟲研究是兩個(gè)獨(dú)立的研究課題。 第一部分蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的建立與完善 優(yōu)化了雙向電泳-MALDI質(zhì)譜分析有關(guān)的方法，包括蛋白質(zhì)樣品的前處理方法的選擇和優(yōu)化，雙向電泳、膠內(nèi)酶解的方法和優(yōu)化，MALDI-MS分析，以及數(shù)據(jù)庫(kù)建立和手工解譜等；另外，建立并改善了色譜分離、質(zhì)譜分析的技術(shù)

5、體系、以及相應(yīng)的大規(guī)模數(shù)據(jù)分析的技術(shù)策略。這些工作，搭建和完善了本單位的蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)，為本論文后續(xù)CD34+細(xì)胞和日本血吸蟲的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分人CD34+造血干/祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組/蛋白質(zhì)組學(xué)研究 CD34+造血干細(xì)胞可以自我更新和分化成為血液細(xì)胞，近來(lái)有報(bào)道認(rèn)為這些細(xì)胞還可以分化成為非血液細(xì)胞。CD34+細(xì)胞是研究最多的干細(xì)胞，最近也有人應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了研究，但

6、是結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法，系統(tǒng)地研究CD34+細(xì)胞還未見(jiàn)報(bào)道。我們收集了臍帶血CD34+細(xì)胞，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，包括雙向電泳、微量液相色譜等技術(shù)分離蛋白質(zhì)、生物質(zhì)譜儀蛋白質(zhì)定量與定性測(cè)定，研究分析了CD34+細(xì)胞的蛋白質(zhì)組。 在CD34+細(xì)胞中鑒定了370個(gè)蛋白質(zhì)，其中52個(gè)蛋白質(zhì)與代謝、細(xì)胞骨架有關(guān)。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)還顯示，CD34+細(xì)胞自我更新還需要其它與細(xì)胞分裂、染色質(zhì)調(diào)控、RNA處理以及蛋白

7、合成、蛋白折疊、蛋白修飾和蛋白降解有關(guān)的蛋白質(zhì)。 我們還鑒定出CD34+細(xì)胞中46個(gè)未知蛋白，證明了相關(guān)未知基因的表達(dá)。我們應(yīng)用間接免疫熒光測(cè)定方法選擇性地驗(yàn)證了四個(gè)代表性的蛋白質(zhì)，包括膜蛋白、胞漿蛋白和核蛋白，結(jié)果證明了質(zhì)譜鑒定所得到的數(shù)據(jù)的可靠性。 本研究鑒定了各種成血細(xì)胞的代表性標(biāo)志。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明了臍帶血CD34+細(xì)胞具有多能分化潛力，可以成為不同的成血細(xì)胞。 我們還驚奇地發(fā)現(xiàn)，臍帶血CD34+

8、細(xì)胞內(nèi)含有通常與神經(jīng)發(fā)育、眼睛、性腺發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，這顯然提示CD34+細(xì)胞具有某種程度的可塑性，也就是造血干細(xì)胞可能分化成為非血液細(xì)胞。這也正是近年來(lái)干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)之一，因?yàn)楦杉?xì)胞的可塑性意義重大，它為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用帶來(lái)的光明的前景。我們的數(shù)據(jù)還顯示，CD34+細(xì)胞表達(dá)一些激素和細(xì)胞因子，這說(shuō)明這些因子可能通過(guò)自分泌和旁分泌，影響CD34+造血干細(xì)胞的自我更新與分化。 我們通過(guò)對(duì)CD34+細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了以往

9、多個(gè)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究所未能發(fā)現(xiàn)的133個(gè)蛋白質(zhì)，并用RT-PCR驗(yàn)證了它們的轉(zhuǎn)錄本。 本研究發(fā)現(xiàn)，有33個(gè)蛋白在2DE膠上有兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白點(diǎn)。最多的是烯醇化酶，有20個(gè)蛋白點(diǎn)。我們分析了大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在比較了基因的各種剪切變化和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)后，我們發(fā)現(xiàn)，這些蛋白在膠上的異質(zhì)性的主要原因是翻譯后修飾，而不轉(zhuǎn)錄水平上的剪切。 在轉(zhuǎn)錄組中有128個(gè)基因的反義轉(zhuǎn)錄本以及相應(yīng)的正義轉(zhuǎn)錄本序列，我們意外地發(fā)現(xiàn)，具有反義轉(zhuǎn)錄

10、本的15個(gè)蛋白質(zhì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中，這個(gè)有趣的現(xiàn)象說(shuō)明在反義轉(zhuǎn)錄本存在的條件下，正義轉(zhuǎn)錄本可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而沒(méi)有完全被反義轉(zhuǎn)錄本阻斷?；蚴欠癖磉_(dá)，可能取決于正義和反義轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)比例。 第三部分日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄組/蛋白質(zhì)組學(xué)研究 血吸蟲病造成嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。我們首次對(duì)日本血吸蟲(Schistosomajapomcum)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行了整合比較分析。在本研究中，我們獲得了日本血吸蟲84000個(gè)EST序列和1

11、5000個(gè)血吸蟲基因，包括8420個(gè)潛在的蛋白編碼基因，建立了世界上最大的日本血吸蟲功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。 我們發(fā)現(xiàn)，在8420蛋白中，有419和583個(gè)基因可能編碼分泌蛋白和膜蛋白，而分泌蛋白是血吸蟲釋放到宿主體液內(nèi)的蛋白來(lái)源，膜蛋白如果在表皮上，則有可能參與宿主-血吸蟲的相互作用。與已知基因有相似性的血吸蟲基因有5077個(gè)，功能分類顯示各個(gè)蟲期功能蛋白的分布比例接近。 結(jié)合色譜或電泳與質(zhì)譜手段，首次對(duì)日本血吸蟲不同生

12、活周期的蛋白表達(dá)譜進(jìn)行了大規(guī)模的廣泛分析，包括尾蚴、肝期童蟲(整個(gè)蟲體和表皮)、成蟲(混合性別成蟲，雌蟲，雄蟲以及它們的表皮)、卵(整個(gè)卵以及空的卵殼)和毛蚴。血吸蟲樣品的蛋白分離組份超過(guò)400個(gè)，采集的串聯(lián)質(zhì)譜圖超過(guò)42萬(wàn)個(gè)。鑒定了26484個(gè)非冗余肽段，代表3260個(gè)不同的血吸蟲蛋白，其中，在尾蚴、肝期童蟲、成蟲、卵和毛蚴中分別鑒定了～900-1400個(gè)蛋白，其中各個(gè)蟲期特有的蛋白為～230-470個(gè)，這反映了不同生活周期的血吸蟲適

13、應(yīng)不同的生活環(huán)境。 將不同生活周期的EST和蛋白情況進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)交蓋程度比較高，最高的達(dá)到86.8﹪，而通常認(rèn)為蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的重疊率只有30﹪。 鑒定了373個(gè)血吸蟲表皮蛋白，來(lái)自雌蟲、雄蟲、混合性別成蟲和肝期童蟲。除少數(shù)已知表皮蛋白外，大量的表皮蛋白都是新鑒定的。這些表皮蛋白的鑒定，為疫苗的研制和藥物靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)，提供了前所未有的選擇余地。 鑒定了520個(gè)血吸蟲卵殼蛋白，

14、第一次明確了卵殼的蛋白組成。發(fā)現(xiàn)卵殼含有與抵抗氧化壓力、免疫、粘附有關(guān)的蛋白，以及參與鈣流動(dòng)通路和肉芽腫形成機(jī)制的蛋白。這為理解宿主-血吸蟲的相互作用提供了重要的信息。 血吸蟲的基因里，鑒定了～7000個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其中一些位點(diǎn)造成蛋白突變，或者產(chǎn)生加長(zhǎng)或縮短的蛋白產(chǎn)物。我們還發(fā)現(xiàn)大量的血吸蟲基因處于純化選擇壓力之下，而少數(shù)基因則處于正選擇壓力下?；蚪M序列測(cè)序和質(zhì)譜數(shù)據(jù)證實(shí)了一些基因的多態(tài)性位點(diǎn)。我們還在血吸蟲基

15、因中發(fā)現(xiàn)了大量的插入和缺失長(zhǎng)度變化以及微衛(wèi)星位點(diǎn)。血吸蟲基因的這些多態(tài)性變化，可能與感染性的差異、中間宿主和終宿主內(nèi)的發(fā)育、對(duì)藥物的敏感性以及致病性和免疫原性有關(guān)。這些新的發(fā)現(xiàn)為解釋血吸蟲逃避、調(diào)節(jié)或削弱宿主免疫反應(yīng)提供了證據(jù)。 在比較了血吸蟲蛋白和其它模式動(dòng)物的蛋白序列后，得到了1336個(gè)進(jìn)化上高度保守的日本血吸蟲蛋白，有助于了解血吸蟲的抗原模擬、免疫逃避和寄生蟲的免疫依賴性生長(zhǎng)。我們還分析了得到了1323個(gè)潛在的血吸蟲特異

16、蛋白，這為治療血吸蟲病的疫苗、藥物、診斷試劑，提供了潛在的靶點(diǎn)。 日本血吸蟲成蟲會(huì)吸附宿主蛋白包被其體表，以避免宿主的免疫攻擊。我們分析了日本血吸蟲樣品中“污染”的宿主蛋白。本研究中，我們采用大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了血吸蟲樣品“污染”的宿主蛋白。我們?cè)谘x樣品中發(fā)現(xiàn)63個(gè)宿主蛋白，其中有1、2、27和40個(gè)蛋白分別在尾蚴、童蟲、成蟲和卵中。這是首次發(fā)現(xiàn)如此多的宿主蛋白可能與血吸蟲密切相互作用。這些宿主蛋白與宿主在血吸蟲感