腎臟近曲小管細胞AT2受體激活對TGF-βRⅡ的影響及其機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　腎間質(zhì)纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是由多種因素引發(fā)的腎臟病理過程，是慢性腎臟疾病發(fā)展為終末期腎臟衰竭的共同病變過程，其組織學(xué)特征為正常的腎間質(zhì)和腎小管結(jié)構(gòu)被過量細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）代替，從而導(dǎo)致ECM合成與降解失衡，以及腎間質(zhì)成纖維細胞大量增生。腎間質(zhì)纖維化作為慢性腎病的終末階段，預(yù)后很差。這使得腎間質(zhì)纖維化一直以來在基礎(chǔ)研究

2、與臨床治療中均受到重視。針對腎間質(zhì)纖維化的主要發(fā)生機制，探索具有針對性的治療方法，對減緩終末期腎臟疾?。‥ndstage renal disease，ESRD）的進程及延長患者壽命具有十分重大的臨床意義。
　　現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化（Epithelial to mesenchymal transition，EMT）是腎間質(zhì)纖維化產(chǎn)生的主要病變原因。EMT是由小管上皮細胞異常轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細胞的病理過程。在該過

3、程中，小管上皮細胞失去了其應(yīng)有的上皮表型，相反卻獲得了間充質(zhì)細胞表型。這個表型轉(zhuǎn)化的過程包括了間充質(zhì)細胞標志性蛋白表達的異常增加，如：α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）；與之相反的是，腎小管上皮細胞在多種因素下失去黏附性，并逐漸失去了上皮細胞的標志性蛋白，如：上皮型鈣粘蛋白（E-cadherin）。發(fā)生轉(zhuǎn)分化后的細胞不管是在細胞形態(tài)上，還是在相應(yīng)細胞功能上均出現(xiàn)不同的特征性變化，尤其是過度合成和

4、分泌 ECM，從而促進腎間質(zhì)纖維化的病理發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)大量生長因子或細胞因子均可以促進EMT發(fā)生發(fā)展，其中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β, TGF-β）是目前公認的作用最強的啟動和調(diào)控EMT過程的生長因子。TGF-β首先與TGF-β受體Ⅱ（TGF-βreceptor typeⅡ，TGF-βRⅡ）結(jié)合，后者磷酸化并活化TGF-β受體Ⅰ（TGF-βreceptor typeⅠ，TGF-βRⅠ），

5、活化的 TGF-βRI進而磷酸化激活下游的經(jīng)典 Smad信號通路和非Smad信號途徑，進而發(fā)揮各類生理病理學(xué)效應(yīng)。其中，TGF-β受體是TGF-β發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)的起始和關(guān)鍵點，TGF-β的作用效應(yīng)強弱很大程度上與受體激活密切關(guān)聯(lián)。如何通過抑制受體表達及其功能，從而改變TGF-β介導(dǎo)的促EMT效應(yīng)就成為了防治腎間質(zhì)纖維化的重要研究領(lǐng)域。
　　血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ, AngⅡ）是經(jīng)典的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin

6、-angiotensin system, RAS）的核心效應(yīng)因子。血管緊張素Ⅱ主要通過其相應(yīng)的受體（AT1受體和AT2受體）在體內(nèi)發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)。其中，AT1受體介導(dǎo)了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管收縮、水鈉重吸收以及促進炎癥等大部分生理學(xué)效應(yīng)；相反，AT2受體則一般被認為在功能上拮抗AT1受體的作用，主要發(fā)揮促進尿鈉排泄、降血壓、降低炎癥等多種效應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ受體與 TGF-β受體之間在腎臟和心血管系統(tǒng)中具有多種相互作用。AT

7、2受體和TGF-β受體在腎臟近曲小管上皮中均有良好表達，但是AT2受體是否可以調(diào)節(jié)TGF-β受體的表達及其介導(dǎo)的促EMT效應(yīng)尚不清楚。
　　基于以上分析，我們在本研究中通過體外實驗，以人腎臟近曲小管上皮細胞（ HK-2）為主要研究對象，觀察了 AT2受體激動后對TGF-βRII表達的影響；研究了激動AT2受體對TGF-β1介導(dǎo)的促EMT效應(yīng)是否具有抑制效應(yīng)；同時，利用免疫熒光激光共聚焦、免疫共沉淀等多種方法研究AT2受體和TGF-

8、βRⅡ之間在人腎臟近曲小管上皮細胞中是否存在細胞內(nèi)共定位或受體之間的直接物理連接；而且，深入探討了激動AT2受體調(diào)節(jié)TGF-βRⅡ表達的分子信號機制。上述問題的解決，將明確AT2受體對TGF-βRⅡ表達及其促EMT作用的抑制效應(yīng)，具有重要生理意義，也為腎間質(zhì)纖維化的有效防治提供了新的思路和重要的理論與實驗依據(jù)。
　　研究內(nèi)容與方法：
　　1.以人腎臟近曲小管上皮細胞（HK-2）為研究對象，采用免疫印跡方法研究激活A(yù)T2受體后

9、是否影響HK-2細胞中TGF-β受體的蛋白表達水平，探討AT2受體作用的受體特異性，即區(qū)分激活A(yù)T2受體后分別對哪一種TGF-β受體（TGF-βRI或TGF-βRI）的表達產(chǎn)生影響作用，同時觀察AT2受體對TGF-β受體的效應(yīng)是否具有組織特異性；
　　2.形態(tài)學(xué)上觀察 TGF-β1和 AT2受體激動劑 CGP42112A作用HK-2細胞后，細胞的形態(tài)學(xué)改變；并分別利用免疫熒光染色和免疫印跡方法研究AT2受體激動劑CGP42112A

10、與TGF-β1共作用HK-2細胞后，對TGF-β1誘導(dǎo)的間充質(zhì)細胞的標志性蛋白α-SMA以及上皮細胞標志性蛋白E-cadherin的蛋白表達的影響；
　　3.分別利用酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）和免疫印跡方法檢測細胞培養(yǎng)基和細胞中的 TGF-β1表達或分泌情況；
　　4.利用免疫熒光激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察 AT2受體和TGF-βRⅡ在基礎(chǔ)狀態(tài)HK-2細

11、胞中是否具有受體共定位；激動AT2受體之后，這兩個受體之間的共定位程度是否發(fā)生變化；
　　5.采用免疫共沉淀技術(shù)，觀察AT2受體和TGF-βRⅡ在基礎(chǔ)狀態(tài)HK-2細胞中是否具有直接物理連接；激動 AT2受體之后，該物理連接是否發(fā)生變化；
　　6.觀察AT2受體激動劑CGP42112A對TGF-βRⅡ蛋白衰減的調(diào)節(jié)作用；
　　7.觀察在NO合成酶抑制劑L-NAME預(yù)處理HK-2細胞后，激動AT2受體對 TGF-βRⅡ蛋白

12、表達以及 EMT變化的標志性蛋白α-SMA和E-cadherin等的調(diào)節(jié)作用是否改變。
　　研究結(jié)果：
　　1. AT2受體激動劑CGP42112A作用HK-2細胞后，可以顯著降低TGF-βRⅡ蛋白表達，該作用呈現(xiàn)濃度與時間依賴性關(guān)系。在AT2受體拮抗劑 PD123319和 PD123177存在的情況下， CGP42112A降低TGF-βRⅡ蛋白表達的效應(yīng)受到明顯阻斷，提示 AT2受體作用的特異性。但是，AT2受體激動后，對

13、TGF-βRI蛋白表達沒有影響，提示其作用的效應(yīng)受體特異性；而且，CGP42112A對心肌細胞中的TGF-βRⅡ表達沒有影響。
　　2. TGF-β1處理HK-2細胞后，可見HK-2細胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，明顯由上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，間充質(zhì)細胞標志性蛋白α-SMA表達明顯增加，上皮細胞標志性蛋白E-cadherin蛋白表達明顯降低，上述效應(yīng)均呈現(xiàn)時間依賴性。
　　3. AT2受體激動劑CGP42112A與TGF-β1共處

14、理HK-2細胞后，可以明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細胞形態(tài)學(xué)改變，一定程度減輕了TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA表達增加和上皮細胞標志性蛋白E-cadherin表達降低。免疫熒光染色實驗同樣證實了 CGP42112A在 HK-2細胞中可以有效阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA和E-cadherin的表達改變。
　　4. AT2受體激動劑CGP42112A處理HK-2細胞后，對細胞培養(yǎng)基中TGF-β1蛋白水平和細胞內(nèi)TGF-β1表達

15、水平均沒有影響。
　　5.在基礎(chǔ)狀態(tài)HK-2細胞中，AT2受體和TGF-βRⅡ在細胞中存在共定位；而且AT2受體短時間（30分鐘）作用后，該共定位明顯增強。同時，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，AT2受體和TGF-βRⅡ也存在直接的物理連接，且該物理連接在AT2受體激動劑短時間作用后得到顯著增加。
　　6. AT2受體激動劑CGP42112A能夠加速HK-2細胞中TGF-βRII蛋白衰減。
　　7. NO合成酶抑制劑 L-NAME可以明

16、顯抑制 AT2受體激動劑CGP42112A對TGF-βRII表達的調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1. AT2受體激動劑CGP42112A作用HK-2細胞后，可以顯著降低TGF-βRⅡ蛋白表達，該作用具有受體特異性。
　　2. AT2受體激動劑CGP42112A可以顯著抑制 TGF-βRⅡ介導(dǎo)的HK-2細胞EMT效應(yīng)。
　　3. AT2受體和TGF-βRⅡ在HK-2細胞中存在共定位和直接的物理連接。激動AT2受體后可