化膿隱秘桿菌溶血素蛋白誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)是革蘭氏陽性短棒狀桿菌，是牛、羊和豬等重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的條件性致病菌，常寄生于上呼吸道和消化道的黏膜處，可引起多種器官和黏膜的化膿性感染，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。Pyolysin(PLO)是化膿隱秘桿菌分泌的一種外毒素，是化膿隱秘桿菌的一種重要毒力因子，具有溶細(xì)胞等生物學(xué)活性。但是溶血素在化膿隱秘桿菌感染宿主的過程中的毒力機(jī)制，目前尚不十分清楚。
　　 本研究克隆了

2、編碼化膿隱秘桿菌溶血素蛋白的plo基因，進(jìn)行原核表達(dá)PLO，檢測(cè)表達(dá)蛋白的溶血活性，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的重組PLO蛋白具有明顯的溶血活性，并利用重組蛋白制備了多克隆抗體，所制備的多抗能夠有效的阻斷溶血素的溶血活性。
　　 將重組PLO蛋白作用小鼠腹膜巨噬細(xì)胞RAW264.7，光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡觀察表明重組PLO能夠誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，如凋亡小體的出現(xiàn)、核固縮、染色質(zhì)聚集等;DNA Ladder檢測(cè)結(jié)果顯示，

3、染色體DNA在瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)典型的“梯形”條帶;Annexin V法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示:0.5μg/mL溶血素處理RAW264.7細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞凋亡率達(dá)到50.1％; MTT法檢測(cè)PLO對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示:一定濃度下溶血素蛋白對(duì)小鼠RAW264.7有明顯的增殖抑制作用，呈劑量和時(shí)間依賴性;試劑盒檢測(cè)caspase3的活性，發(fā)現(xiàn)caspase3活性均比對(duì)照組升高;并檢測(cè)重組PLO蛋

4、白對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等細(xì)胞因子的影響，結(jié)果顯示:RAW264.7細(xì)胞負(fù)載溶血素后TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10細(xì)胞因子分泌量有不同程度的提高。這表明溶血素蛋白能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，并產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子。
　　 綜上所述，本研究原核表達(dá)了化膿隱秘桿菌溶血素蛋白，鑒定其生物學(xué)功能并將其作用于小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，研究溶血素誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞凋亡，為溶