DLP，一個(gè)新的DIM1蛋白家族成員-參與Pre-mRNA剪接與細(xì)胞周期調(diào)控.pdf

1、我們在對一個(gè)細(xì)胞因子類似因子-CKLF的研究過程中,發(fā)現(xiàn)在其染色體區(qū)域附近約10 Mb處存在一個(gè)新的蛋白質(zhì)編碼基因.對這個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,沒有得到有關(guān)趨化因子的提示,這個(gè)基因的結(jié)構(gòu)分析表明從4-135氨基酸為一個(gè)DIM1結(jié)構(gòu)域,因此我們將這個(gè)基因編碼的蛋白稱為DIM1-like Protein(DLP).氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)DLP與酵母的一個(gè)15 KD的剪接體蛋白U5有弱的同源性,和一種有絲分裂蛋白DIM1及人硫氧還蛋白

2、分別有39%、24%的同源性,同時(shí)發(fā)現(xiàn)它在人、鼠、Arabidopsis thaliana、Oryza、melanogaster、果蠅、酵母菌等各種屬之間有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?DLP的序列與Golemis命名的DIM2相同(Zhang et al.1999).因此,我們推測DLP也許是DIM1家族的成員之一.向GenBank提交登記獲得接受,GenBank的登記號為AY566808.DIM1屬近幾年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)硫氧還原蛋白超家族的第六分支.在人

3、和酵母中,DIM1蛋白是U4/U6和U5 tri-snRNP的一個(gè)亞基,其突變能使細(xì)胞停滯在G2/M期并且影響Pre-mRNA剪接過程.考慮到DIM1蛋白可能是通過影響Pre-mRNA的剪接來間接影響細(xì)胞周期,所以我們設(shè)想DLP也可能參與Pre-mRNA剪接的過程.我們首先對DLP進(jìn)行表達(dá)譜分析,Nothem Blot顯示DLP在骨骼肌、肝臟、心臟和胰腺中高表達(dá),在腎臟,腦和胎盤中中等程度的表達(dá),在肺中表達(dá)較低.RT-PCR證實(shí)DLP在

4、人的乳腺癌細(xì)胞MCF-7,肝癌細(xì)胞HepG2和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa中也有高表達(dá).說明DLP在體內(nèi)多個(gè)組織均有表達(dá)但又有特異性.用綠色熒光蛋白做定位表明DLP定位于核內(nèi),推測DLP可能在剪接和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用.在原核細(xì)胞中表達(dá)了DLP,并免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體.利用制備的多克隆抗體進(jìn)行Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)DLP在MCF-7細(xì)胞中有內(nèi)源性表達(dá).用GST Pull-down實(shí)驗(yàn)篩選DLP相互作用的蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)D

5、LP與剪接相關(guān)因子Prp6(U5-102 KD)在體外存在直接的相互作用.缺失體研究證實(shí)DLPN端的33個(gè)氨基酸是與Prp6相互作用的區(qū)域.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和酵母雙雜實(shí)驗(yàn)以及共聚焦進(jìn)一步證明DLP和Prp6的確存在相互作用.體外剪接實(shí)驗(yàn)證實(shí)DLP能促進(jìn)剪接底物Adml-M3 Pre-mRNA的剪接.我們的研究結(jié)果表明DLP可能是一個(gè)新的參與Pre-mRNA剪接和細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白因子.DLP的發(fā)現(xiàn)不僅提供了一個(gè)發(fā)現(xiàn)新的功能基因的實(shí)例,而且