重組人促紅細胞生成素誘導人源羊水干細胞向心肌前體細胞的分化及其Wnt信號通路機制的研究.pdf

1、目的：
　　觀察不同濃度重組人促紅細胞生成素(recombinant humanerythropoietin，rhEPO)對人源羊水干細胞(amniotic fluid stem cells，AFSC)向心肌前體細胞分化的作用及觀察該分化過程中可能參與的Wnt信號機制。
　　方法：
　　(1)擴增、純化AFSC。
　　(2)倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的羊水干細胞的一般生物學特性。采用流式細胞術檢測AFSC的CD29

2、及CD34的表達情況。
　　(3)本實驗分為對照組，rhEPO組，rhEPO+LiCl組。
　　(4)對照組一直使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；rhEPO組用對照組的培養(yǎng)基中加入rhEPO組成的誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，且rhEP0的終濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0U/ml，干預24h后換成與對照組相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)；rhEPO+LiCl組用上述濃度的rhEPO組成的誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)并在誘導分化液中各加上5mmol/L的wnt信號激動劑

3、LiCl干預24h，然后換成與對照組相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　(5)將鑒定后的細胞種于10*10的小玻片上，按上述要求進行干預，48h后，用免疫熒光法檢測羊水干細胞在誘導前及誘導早期的促紅細胞生成素受體(EPOR)的表達情況。用免疫組化檢測β-catenin及p-GSK-3β(ser9)的表達情況。
　　(6)2周后在倒置顯微鏡下觀察誘導分化后的細胞，計算有形態(tài)改變的心肌前體細胞數占總細胞數的比率為分化率，并比較rhEPO組與

4、對照組的分化率的差異。
　　(7)14天后收集各組細胞，提取總的RNA，應用RT-PCR檢測各組心肌早期轉錄因子GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表達情況。
　　(8)28天后應用Western blot檢測各組細胞心肌特異蛋白(β-MHC、cTnT)的表達情況。
　　結果：
　　(1)羊水內的細胞接種后原代靜養(yǎng)7天，第8天在倒置顯微鏡下可見集落細胞團，集落分布不均，大小不一，集落周邊僅有很少量細胞，集落中心

5、細胞易可見老化凋亡的細胞。羊水干細胞生長快，傳代后細胞平鋪時體積大，核仁大，胞漿豐富，細胞生長較密時，細胞似成纖維樣細胞，排列成漩渦狀。
　　(2)AFSC經流式細胞儀檢測顯示AFSC表型為CD29+為97.04％，CD34+為0.61％。
　　(3)免疫熒光觀察到AFSC在誘導前和誘導早期均有EPOR的表達。
　　(4)誘導分化第14天，倒置顯微鏡下可見細胞由長梭形逐漸變短增寬，相鄰的細胞間有融合現象，似類肌管樣結構

6、。不同濃度的rhEPO誘導的分化率有差異，但都顯著高于對照組(P<0.05)，且以5.0U/mLrhEPO的誘導分化率最高(P<0.05)。
　　(5)在誘導分化14天后，與未干預組比較，各濃度rhEPO組及各濃度rhEPO+LiCl組干預后細胞的GATA-4、Nkx2.5 mRNA的表達明顯上調(P<0.05)，以5.0 U/ml的作用最顯著；與rhEPO組比較，rhEPO+Licl組能顯著干預上調誘導細胞的GATA-4、Nkx

7、2.5mRNA的表達(P<0.05)，以5.0 U/ml rhEPO+5mmol/L的LiCl干預作用最強。
　　(6)經誘導28天后，各干預組的細胞的心肌特異相關蛋白β-MHC、cTnT的表達明顯上調(P<0.05)，以5.0 U/ml的作用最顯著，而rhEPO與Wnt信號激動劑共同作用強于單用rhEPO。
　　(7)誘導過程中各組均有如前所述的Wnt信號通路中的蛋白表達，與對照組比較，rhEPO及rhEPO+LiCl組β

8、-catenin及p-GSK-3β的表達的增多(P<0.05)，與rhEPO比較，rhEPO+LiCl組β-catenin p-GSK-3β的表達強于rhEPO組。
　　結論：
　　(1)人源羊水中存在AFSC，其性質類似于間充質干細胞及胚胎干細胞。
　　(2)外源性rhEPO成素能作為一種化學誘導劑應用于干細胞的研究。
　　(3)外源性rhEPO早期干預能劑量依賴性促進人源羊水干細胞向心肌前體細胞分化。