柚皮素緩解慢傳輸型便秘及其相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：慢傳輸型便秘(STC)是便秘中最常見的類型，在老年人尤其是女性中發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，主要臨床表現(xiàn)是結(jié)腸動(dòng)力低下、結(jié)腸傳輸時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致以大便次數(shù)減少、便意缺乏、排便困難、腹脹等癥狀為主的疾病，STC發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。但目前研究表明STC的發(fā)病病理生理機(jī)制與腸神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)遞質(zhì)異常、平滑肌異常、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)異常、腸道水通道蛋白異常以及精神心理等多因素有關(guān)。目前治療便秘的藥物主要有胃腸動(dòng)力藥和各種

2、類型的瀉劑，但長(zhǎng)期服用易引起水電解質(zhì)紊亂，對(duì)人體產(chǎn)生副作用。柚皮素屬于天然中草藥，因具有多層次、多位點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)、療效穩(wěn)定的特點(diǎn)以及毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，在便秘的治療中更有希望取得整體療效，具有良好的應(yīng)用前景。柚皮素是柚皮苷的苷元，為三羥基黃酮，屬于二氫黃酮類化合物。既往研究顯示出柚皮素在降血脂、抗炎、抗真菌、抗氧化等方而具有較強(qiáng)的生物活性。進(jìn)一步研究慢傳輸型便秘的病理生理機(jī)制并探討柚皮素的作用途徑對(duì)STC的預(yù)防和治療具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)

3、實(shí)意義。本研究通過建立便秘小鼠動(dòng)物模型，驗(yàn)證柚皮素對(duì)便秘小鼠血清中胃腸道激素MTL、Gas、ET、SS以及腸神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)AChE、SP、VIP含量的影響;觀察柚皮素對(duì)便秘小鼠近端、遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中黏膜層、肌層及肌間神經(jīng)叢病理性改變的影響;探討柚皮素對(duì)便秘小鼠近端、遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中腸神經(jīng)相關(guān)因子表達(dá)的影響;探究柚皮素對(duì)便秘小鼠近端、遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中Cajal間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響;揭示柚皮素對(duì)便秘小鼠近端、遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中水通道蛋白表達(dá)的影響。

4、
　　方法：選取健康雄性ICR小鼠建立便秘模型，將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、柚皮素低劑量組、柚皮素中劑量組、柚皮素高劑量組，每組6只。模型組和給藥組灌胃給予洛哌丁胺3mg/kg，對(duì)照組給予等量生理鹽水，1h后給藥組分別灌胃給予柚皮素75、150、300 mg/kg，模型組和對(duì)照組給等量生理鹽水。每日1次，持續(xù)5天。而后分別收集糞便參數(shù)，如糞便顆粒數(shù)，糞便重量，糞便含水量。末次給藥后第2天（第6天），各組小鼠禁食不禁水，灌胃給予

5、5％炭末-10％阿拉伯膠配成的半固體糊（1ml/100g體重），30min后處死小鼠，剖開腹腔，留取血液標(biāo)本，留待血清學(xué)檢測(cè)。計(jì)算小腸推進(jìn)率等證實(shí)便秘模型建立成功。留取小鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，部分凍存，部分甲醛固定，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中胃腸道激素如胃動(dòng)素(MTL)，胃泌素(GAS)，內(nèi)皮素(ET)，生長(zhǎng)激素抑制素(SS)，腸神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)乙酰膽堿(AChE)，P物質(zhì)(SP)，血管活性腸肽含量(VIP)。通過HE

6、染色檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織，尤其是平滑肌細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)改變情況。通過Western blot方法檢測(cè)瞬變受體陽(yáng)離子通道亞科V1（TRPV1）和一氧化氮合酶(NOS)蛋白表達(dá)結(jié)果;檢測(cè)腸神經(jīng)相關(guān)因子膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)蛋白表達(dá)結(jié)果;檢測(cè)Cajal間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物c-kit以及干細(xì)胞因子(SCF)蛋白表達(dá)結(jié)果;檢測(cè)水通道蛋白AQP1，AQP3，AQP9蛋白表達(dá)結(jié)果。通過Rt PCR熒光定量方法檢測(cè)T

7、RPV1和NOS mRNA表達(dá)結(jié)果;檢測(cè)腸神經(jīng)相關(guān)因子GDNF和BDNF mRNA表達(dá)結(jié)果;檢測(cè)Cajal間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物c-kit以及SCF mRNA表達(dá)結(jié)果;檢測(cè)水通道蛋白AQP1，AQP3，AQP9 mRNA表達(dá)結(jié)果。通過免疫組化檢測(cè)水通道蛋白AQP1，AQP3，AQP9的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴成功誘導(dǎo)了便秘小鼠模型，模型組與正常對(duì)照組相比，小鼠糞便顆粒數(shù)減少、糞便重量及含水量均下降，小腸推進(jìn)率顯著下降，柚皮素干預(yù)有效增

8、加糞便顆粒數(shù)、糞便重量及含水量，增加小腸推進(jìn)率，且呈劑量依賴性。⑵便秘模型組小鼠血清中胃腸道激素SS無顯著差異，胃腸道激素MTL，GAS，ET，腸神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)AChE， SP， VIP含量較對(duì)照組下降，柚皮素呈劑量依賴性增加上述指標(biāo)的表達(dá)水平。⑶便秘小鼠模型組小鼠平滑肌明顯變薄，并且有平滑肌細(xì)胞胞體萎縮，細(xì)胞失去緊密有序的排列，杯狀細(xì)胞不完整;柚皮素干預(yù)組與正常組結(jié)腸平滑肌厚度接近，細(xì)胞排列整齊。⑷便秘小鼠模型組與正常對(duì)照組相比，ICC

9、分子標(biāo)志物c-kit與SCF表達(dá)水平降低，柚皮素干預(yù)能顯著增加c-kit和SCF mRNA和蛋白表達(dá)水平。⑸便秘小鼠模型組與正常對(duì)照組相比，結(jié)腸組織中水通道蛋白AQP9無顯著差異，近端結(jié)腸組織中AQP3表達(dá)水平顯著下降，而柚皮素干預(yù)能顯著增加AQP3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：①柚皮素能夠促進(jìn)胃腸道激素MTL，GAS，ET的分泌，上調(diào)腸神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)AChE， SP，VIP的表達(dá)水平，從而緩解慢傳輸型便秘。②柚皮素通過促進(jìn)