人核心結(jié)合因子（Cbfal）腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、核心結(jié)合因子(core-binding factor α1,Cbfa1)是近幾年發(fā)現(xiàn)的與骨發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,在成骨細(xì)胞分化和骨形成過程中發(fā)揮重要作用.該研究利用腺病毒載體系統(tǒng),構(gòu)建hCbfa1腺病毒載體,以用于人造骨移植修復(fù)骨缺損.用PCR法從質(zhì)粒中擴(kuò)增hCbfa1基因,凝膠回收后補(bǔ)平末端,與粘粒載體pAwCAwt連接,用λ噬菌體蛋白包裝后轉(zhuǎn)化大腸桿菌.挑取菌落進(jìn)行菌落PCR篩選出含有目的片段的克隆,用BamH Ⅰ酶切進(jìn)一步篩選出

2、正向插入的克隆,最后進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank的hCbfa1基因序列對(duì)比,有一個(gè)同義突變.所得粘粒pAxCAwt.hCbfa1與DNA-TPC用磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,在其中同源重組,得到有感染活性的第一代病毒Ad.hCbfa1.在第二代病毒篩選中,選擇只能使293細(xì)胞產(chǎn)生病態(tài)反應(yīng)而不能使Hela細(xì)胞產(chǎn)生病態(tài)反應(yīng)的病毒,因?yàn)樗鼈儧]有E1基因不能在非293細(xì)胞中繁殖.然后進(jìn)行第三代和第四代病毒擴(kuò)增,并且進(jìn)行篩選,排除野生型的

3、病毒.用50﹪組織培養(yǎng)感染量TCID<,50>法測(cè)定病毒滴度為4.7×10<'8>pfu/ml.用Ad.hCbfa1感染Hela細(xì)胞后提取細(xì)胞RNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量分析,OD<,260>/OD<,280>=1.97,OD<,260>/OD<,230>值為2.05,RNA濃度=1.572μg/μl.用DNase去除RNA中的基因組DNA,然后用RT-PCR法鑒定,能夠擴(kuò)增出1500bp左右的片段,說明所提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cD