表達(dá)F4+ETEC的靶向性乳酸桿菌活菌載體的構(gòu)建及其免疫原性分析.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的主要病原體，也是仔豬腹瀉的重要誘因，其中以F4+ ETEC占據(jù)優(yōu)勢地位，因此控制F4+ETEC感染成為防治仔豬腹瀉關(guān)鍵一環(huán)。仔豬腹瀉是長期困擾豬場和養(yǎng)殖戶的一個難題，不僅帶來直接的死亡損失和大量的藥費(fèi)開支，還間接影響到康復(fù)豬下一階段的生長速度、育成率，危害相當(dāng)嚴(yán)重，成為全球范圍內(nèi)影響提高養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要制約因素。

2、
　　 本研究首先克隆了F4+ ETEC FaeG、STa-LTB、STb基因，采用融合PCR或SOE-PCR方法，克隆獲得優(yōu)化組合的新的F4+ETEC保護(hù)性抗原基因STa-LTB-STb-FaeG，在此基礎(chǔ)上引入M細(xì)胞靶向肽col，獲得靶向M細(xì)胞的基因STa-LTB-STb-FaeG-col，之后構(gòu)建表達(dá)FaeG、FaeG-col、STa-LTB-STb-FaeG、STa-LTB-STb-FaeG-col的重組大腸桿菌。SDS

3、-PAGE和Westernblot分析顯示融合基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)。重組表達(dá)的目的蛋白STa-LTB-STb-FaeG、STa-LTB-STb-FaeG-col、FaeG、FaeG-col主要以包涵體的形式存在，提取包涵體，免疫試驗小鼠，測定血清中特異性IgG抗體水平，并用大腸桿菌強(qiáng)毒株對免疫鼠進(jìn)行攻毒試驗。證實目的蛋白無毒性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，M細(xì)胞靶肽修飾的重組蛋白誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生的特異性IgG抗體水平明顯高于未修

4、飾組;M細(xì)胞靶向修飾組通過兩次免疫可抵抗大腸桿菌強(qiáng)毒株（1×109CFU/只）攻擊，保護(hù)率達(dá)到100％。這些結(jié)果表明所構(gòu)建的保護(hù)性抗原是安全有效的，M細(xì)胞靶向肽對抗原具有免疫增強(qiáng)作用。以篩選到的免疫保護(hù)性抗原蛋白的基因FaeG、FaeG-co1、STa-LTB-STb-FaeG（以下簡稱SLSF）、STa-LTB-STb-FaeG-col（以下簡稱SLSF-col）為靶基因，分別亞克隆到分泌表達(dá)型乳酸菌載體pPG-2中，電轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建了

5、表達(dá)F4+ ETEC免疫保護(hù)性抗原蛋白的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)，重組干酪乳桿菌分別命名為pPG-2-FaeG/L.casei393、pPG-2-FaeG-col/L.casei393、pPG-2-SLSF/L.casei393、pPG-2-SLSF-co l/L.casei393。將獲得的重組干酪乳桿菌以1％乳糖為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，Western blot實驗表明，重組的目的蛋白獲得了表達(dá)。
　　 為探討表達(dá)F4+ ETEC免

6、疫保護(hù)性抗原蛋白的重組干酪乳桿菌系統(tǒng)作為活菌疫苗潛在的應(yīng)用價值，本實驗以成年和哺乳期BALB/c小鼠為實驗動物，進(jìn)行免疫原性評價研究。分三種不同的免疫程序進(jìn)行免疫，分別為一次免疫組、三次免疫組及哺乳期小鼠免疫組，口服接種109活菌量，以PBS、pPG-2/L.casei393組作為對照。免疫后收集不同時間段免疫小鼠新鮮糞便、血液、鼻腔沖洗液、外生殖道沖洗液等樣品，分別測定樣品中特異性sIgA以及小鼠血清中IgG。通過流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測

7、Th1、Th2、Th17的表達(dá)水平，MTT法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況。
　　 口服免疫效果表明，一次免疫組pPG-2-FaeG/L.casei393和pPG-2-FaeG-col/L.casei393在一免后第7d即可在血清、糞便及外生殖道中檢測到較高水平的IgG、sIgA抗體，與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，M細(xì)胞靶向修飾組pPG-2-FaeG-col/L.casei393的免疫效果明顯高于未修飾組;三次免疫組p

8、PG-2-SLSF/L.casei393和pPG-2-SLSF-eol/L.casei393在糞便、外生殖道及鼻腔沖洗液中均能檢測到高水平的sIgA抗體，并可檢測到高水平血清IgG抗體，組間差異極顯著(P＜0.01)，與對照組差異極顯著(P＜0.01);哺乳期小鼠免疫組pPG-2-SLSF/L.casei393和pPG-2-SLSF-col/L.casei393在二免后第7d即可在血清、糞便及外生殖道中檢測到較高水平的IgG、sIgA抗

9、體，組間差異顯著(P＜0.05)，與對照組差異極顯著(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠刺激動物產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，其中M細(xì)胞靶向修飾組的抗體水平明顯高于未修飾組。
　　 攻毒試驗結(jié)果表明，一次免疫(one dose)攻毒后，pPG-2-FaeG/L.casei393組小鼠排糞量明顯增多，攻毒后第2d出現(xiàn)水樣便，在攻毒后4d天有一只死亡，第5d排糞便量逐漸減少，第9d恢復(fù)正常，保護(hù)率90％，在攻

10、毒后第10d糞便中檢測不到F4+ ETEC菌株;pPG-2-FaeG-col/L.casei393組攻毒后排糞便量增多，第4d排糞便量逐漸減少，第7d恢復(fù)正常，保護(hù)率100％，在攻毒后8d糞便中檢測不到F4+ETEC菌株;而對照組小鼠在第2d、3d全部死亡。三次免疫效果分析顯示，對照組小鼠在第2d、3d全部死亡的情況下，pPG-2-SLSF/L.casei393組小鼠在攻毒后排糞量增多，第2d出現(xiàn)黏液便，從第3d開始排稀糞量逐漸減少，第

11、6d恢復(fù)正常，無一死亡，在攻毒后第7d糞便中檢測不到F4+ ETEC菌株;pPG-2-SLSF-co l/L.casei393組小鼠排糞便量有輕度的增加，第4d恢復(fù)正常，無一死亡，在攻毒后第5d糞便中檢測不到F4+ ETEC菌株。對哺乳期小鼠免疫結(jié)果顯示，對照組小鼠在第2d全部死亡;pPG-2-SLSF/L.casei393組小鼠在攻毒后排糞量明顯增多，出現(xiàn)黏液便，第4d開始排糞便量逐漸減少，第7d恢復(fù)正常，保護(hù)率100％，在攻毒后第8

12、d糞便中檢測不到F4+ETEC菌株;pPG-2-SLSF-col/L.casei393組在攻毒后排糞量略有增多，第2d出現(xiàn)黏液便，第4d開始排糞便量逐漸減少，第6d恢復(fù)正常，保護(hù)率100％，在攻毒后第7d糞便中檢測不到F4+ ETEC菌株。
　　 本實驗構(gòu)建了表達(dá)F4+ ETEC免疫保護(hù)性抗原蛋白的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)，證實M細(xì)胞靶向策略在乳酸菌活載體疫苗系統(tǒng)中應(yīng)用是確實可行的，說明所構(gòu)建的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為口服疫苗具