煙草尼古丁合成代謝相關(guān)基因研究.pdf

1、生物體內(nèi)存在一組小RNA分子，長度通常只有18-24nt。通過在轉(zhuǎn)錄水平和/或后轉(zhuǎn)錄水平階段，利用特定堿基配對方式與他們的目標(biāo)靶基因序列聯(lián)配，抑制靶基因的表達(dá)。植物小RNA作為一種重要的具有調(diào)控作用的小分子，在植物生長發(fā)育和抵御外部環(huán)境過程中扮演著重要的角色。目前已經(jīng)在許多植物中發(fā)現(xiàn)并鑒定了一大批植物特有的miRNA，但在煙草小RNA尚為空白。尼古丁是煙草次生代謝的主要產(chǎn)物，尼古丁可以通過打頂和葉片損傷的方式在煙草體內(nèi)誘導(dǎo)其合成，尼古丁

2、的代謝途徑中許多節(jié)點(diǎn)或基因目前尚不清楚。本論文主要開展了非編碼小RNA和一個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因在煙草尼古丁合成與代謝途徑相關(guān)性研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 我們通過高通量測序技術(shù)對煙草不同組織（根和葉）和不同損傷處理方式（葉片機(jī)械損傷和打頂）進(jìn)行了小RNA測定。通過生物信息學(xué)分析，在煙草中檢測到了27個(gè)植物保守miRNA家族和38個(gè)煙草特有miRNA家族（59個(gè)miRNA家族成員）;此外我們還在煙草中鑒定出了大批的21或24-nt

3、長度的相位小RNA。通過降解組測序和Northern雜交技術(shù)我們對鑒別出的miRNA和相位小RNA的功能進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證和分析，發(fā)現(xiàn)了一批同煙草生長發(fā)育、尼古丁合成相關(guān)的miRNA以及同煙草植株傷害相關(guān)的小RNA。通過檢測這批小RNA在葉片損傷和打頂傷害處理煙草植株中的表達(dá)量變化以及對它們靶基因的功能分析，結(jié)果表明煙草植株的抗逆生理反應(yīng)很有可能是由這些miRNA和相位小RNA共同調(diào)控的。
　　 去甲基尼古丁是煙草含量中僅次于尼

4、古丁的一種生物堿，約占總煙草生物堿的3％，其合成的途徑主要是通過尼古丁的去甲基化。在前期的工作中我們已經(jīng)克隆出煙草亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR）并構(gòu)建了該基因過表達(dá)和RNAi干擾轉(zhuǎn)基因植株，本研究利用包括4.5萬個(gè)基因的煙草基因芯片對MTHFR過表達(dá)和敲除的植株進(jìn)行了表達(dá)測定?；谠撔酒瑪?shù)據(jù)，我們選取了5個(gè)于尼古丁代謝途徑上的關(guān)鍵調(diào)控基因并對其表達(dá)量進(jìn)行進(jìn)一步的分析。結(jié)果表明MTHFR基因的主要功能在于影響尼古丁和去甲基尼古丁之

5、間的轉(zhuǎn)化，因此不對尼古丁生物合成起關(guān)鍵調(diào)控作用，對于尼古丁合成途徑上游的幾個(gè)關(guān)鍵基因如PMT、QPT和MPO等的表達(dá)并不具備調(diào)控功能。
　　 綜上所述，煙草體內(nèi)尼古丁的合成途徑是一個(gè)很復(fù)雜的生理代謝過程，其中包含了大量由不同基因編碼的酶類蛋白的催化。在這一過程中miRNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)控其靶基因而參與到這一復(fù)雜的生理反應(yīng)當(dāng)中，同時(shí)隨著尼古丁代謝途徑研究的不斷深入以及煙草全基因組序列工作的完成，將會有更多調(diào)控?zé)煵菽峁哦〈x途