惡臭假單胞菌代謝尼古丁分子生物學研究.pdf

1、尼古丁不僅自然存在于煙草制品中，而且還是煙草植物合成的主要生物堿。由于其雜環(huán)化合物結構，尼古丁有很好的水溶性，能夠非常容易的穿過生物膜和血腦屏障。在煙草加工過程中存在大量富含尼古丁等煙堿化合物的固體和液體廢棄物，易進入地下水，給人們的生存環(huán)境帶來了極大威脅。1994年，美國環(huán)?？偩謱⒛峁哦《x為“有毒的危險廢棄物”。因此，從煙草廢棄物中去除尼古丁或者將這些廢棄物轉化成有價值的化合物是十分必要的。煙草科學研究合作中心提出“處理煙草廢物”，

2、并總結了很多處理方法，微生物處理方法是其中建議的快速處理煙草廢物的方法之一。很多微生物能夠生長在煙葉及附近土壤中，并利用尼古丁作為唯一碳氮源和能源。在煙草加工過程中這些微生物對于改善尼古丁含量具有重要的作用。研究微生物降解尼古丁的機理可為揭示尼古丁代謝的化學生物學機制和進一步的應用提供理論依據和參考。 Pseudomonas putida S16是課題組分離出來的一株以尼古丁為唯一碳氮源生長并能高效降解尼古丁的菌株。前期研究已

3、通過核磁波譜、紅外光譜、紫外吸收光譜、氣相質譜、高分辨氣相質譜等分析手段確定該菌株通過吡咯途徑降解尼古丁，但其分子機制還沒有報道過，本文以菌株S16為研究對象，構建基因組文庫，篩選具有尼古丁降解功能的轉化子，對轉化子測序分析，并從nic基因簇中亞克隆到nicA和hsp基因，對基因成功表達，從分子水平研究其降解機理及途徑。 構建了菌株S16的噬菌體和pUC兩種基因組文庫，從文庫中篩選到三個陽性克隆x-2、10-52、GTPF，這

4、三個轉化子都能利用尼古丁作為唯一碳氮源生長。利用三個轉化子休止細胞進行了尼古丁降解，通過高效液相色譜和薄層層析發(fā)現(xiàn)轉化子x-2和10-52降解尼古丁代謝途徑是一致的。通過測序發(fā)現(xiàn)x-2和10-52的基因序列基本一致，x-2的插入片段大小為1.44 kb，10-52插入的片段大小為1.389 kb，兩者具有相同的最大開放閱讀框架(large open reading frame，largeORF)。通過NCBI比對，發(fā)現(xiàn)與一些未知功能的脫

5、氫酶有100％的相似性(如mannitol dehydrogenase)，在其最大ORF的831 bp處，與假設的Fe-S氧化還原酶家族I有60％相似性(LTLTELGRNLPTKARTKHNIKRIDRLLGNRHLHKE)，也與轉座子Tn10中的轉座酶一段序列相似性高達100％，其功能還未知。通過高分辨質譜儀確定了三個重要化合物：化合物1(C10H13N2O2)的分子離子峰為m/z 193.09715((M+H)+)，化合物2(C1

6、0H15N2O2)的分子離子峰為m/z 195.11280((M+H)+)，化合物3(C10H13N2O)的分子離子峰為m/z 177.10224((M+H)+)，這三種化合物都不是尼古丁降解吡咯途徑的中間化合物，它們的結構信息還需要進一步分析。通過高效液相色譜、薄層層析和質譜檢測發(fā)現(xiàn)轉化子GTPF能夠通過吡咯途徑降解尼古丁生成N-甲基麥喔斯明、假氧化尼古丁、3-琥珀酰吡啶、6-羥基-3-琥珀酰吡啶、2,5-二羥基吡啶，與原始菌株S16

7、代謝途徑吻合，說明該轉化子含有吡咯降解途徑關鍵基因，本文主要針對該轉化子開展研究。轉化子GTPF含有的尼古丁降解基因簇的長度為4,879 bp，該基因簇中含有三個ORF。所有的ORF都是以纈氨酸或者甲硫氨酸起始的，長度都長于100個氨基酸。在基因簇的兩端都含有轉錄調節(jié)子的序列。通過分析，在ORF1的上游有SD序列。NCBI BLAST分析發(fā)現(xiàn)，ORF1與細胞色素C氧化酶亞基I和NADH脫氫酶亞基I有40％的相似性，ORF2序列與Phot

8、obacterium profundum SS9假設蛋白有38％相似性，與其它已知功能的蛋白沒有任何相似性。ORF3位于ORF2上游，ORF3序列與P.putida F1菌中超螺旋蛋白有97％的相似性，與P.putida KT2440的轉錄調節(jié)子Asnc家族有97％的相似性。這三個ORF與其它雜環(huán)化合物降解基因沒有相似性，是全新的降解基因。因此，通過進一步的亞克隆分析單個基因的功能是非常必要的。 通過PCR的方法對轉化子GTP

9、F的基因簇進行了亞克隆，構建了多個重組子，對它們代謝尼古丁、3-琥珀酰吡啶、6-羥基-3-琥珀酰吡啶的活力進行了檢測。獲得了尼古丁降解關鍵基因nicA，該基因大小為1,854 bp，能夠將尼古丁降解至3-琥珀酰吡啶，該基因與其它雜環(huán)化合物降解基因沒有相似性，將nicA基因在pET系列載體中表達，純化重組NicA蛋白，初步研究NicA蛋白的性質。通過轉化子的休止細胞降解實驗、純酶轉化實驗推測出了尼古丁代謝途徑，補充了與我們課題組報道的代謝

10、途徑，并第一次用同位素標記的實驗證明了N-甲基麥喔斯明能夠自發(fā)水解生成假氧化尼古丁。 成功克隆了轉化6-羥基-3-琥珀酰吡啶生成2,5-二羥基吡啶的酶的基因hsp，該基因與已報道有功能的蛋白沒有相似性，屬于新的基因，并對該蛋白的二級結構進行了預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在一些Motif與一些功能蛋白有部分相似性。將hsp基因在pET系列載體中表達，純化重組蛋白HSP羥化酶。在此基礎上，初步研究了該酶能夠催化HSP生成DHP和琥珀酸半醛。

11、在成功克隆到nicA和hsp基因以后，我們又進行3-琥珀酰吡啶的基因的克隆，但是目前該基因還沒有尋找到。 根據文獻報道，絕大部分的尼古丁降解菌株的降解基因都位于質粒上，可移動遺傳物質包括質粒和轉座元在新的代謝途徑中起到十分重要的作用。本文也采用多種方法對菌株S16的質粒進行分離檢測。菌株S16質粒的拷貝數(shù)比較低，提取比較困難，通過優(yōu)化樣品制備方法和脈沖場電泳條件，檢測到該菌株中可能含有4個質粒，大小分別為60 kb、200 k