BMP-4對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)歸影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探索骨形態(tài)生發(fā)蛋白4（BMP-4）對(duì)經(jīng)過(guò)與大鼠骨髓間充干細(xì)胞（MSCs）共同培養(yǎng)后的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的分化和存活的影響，為細(xì)胞移植治療脊髓損傷提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
　　方法：提取新生24小時(shí)以內(nèi)SD大鼠的幼鼠的大腦組織，采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，與從SD大鼠股骨骨髓中提取并經(jīng)貼壁梯度培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞建立MSCs與NSCs共培養(yǎng)模型，在共同培養(yǎng)體系中加入BMP-4，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)Annexin V凋亡

2、試劑盒處理后NSCs的存活率，使用細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)對(duì)分化后的 NSCs進(jìn)行免疫熒光染色并統(tǒng)計(jì) NSCs分化后的特異性蛋白 MBP表達(dá)陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元特異性蛋白MAP-2及特異性蛋白GFAP表達(dá)陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況。然后提取分化后細(xì)胞的總蛋白，行Western blot免疫印跡法鑒定 NSCs分化后的少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白 MBP、星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及神經(jīng)元特異性蛋白MAP-2的表達(dá)情況，計(jì)算NSCs的存活率和分化

3、率，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析后明確BMP-4對(duì)共培養(yǎng)后NSCs的存活及分化的影響。
　　結(jié)果：（1）原代培養(yǎng)三代后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈梭形、螺旋狀，形態(tài)大體一致，原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可見(jiàn)大量懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球，經(jīng)過(guò)共同培養(yǎng)后神經(jīng)干細(xì)胞可定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞。（2）利用H2O2制作細(xì)胞凋亡模型，將共培養(yǎng)后的神經(jīng)干細(xì)胞分為4組分別為空白對(duì)照組、H2O2組、H2O2+共培養(yǎng)組及H2O2+共培養(yǎng)+BMP

4、-4組。各組均采用Annexin V-PI細(xì)胞凋亡試劑盒，利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定誘導(dǎo)凋亡后的神經(jīng)干細(xì)胞的存活率。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析可見(jiàn)共培養(yǎng)后的神經(jīng)干細(xì)胞存活率明顯提高，但在共培養(yǎng)體系中加入BMP-4后細(xì)胞存活率出現(xiàn)一定程度的下降，經(jīng)方差分析顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.373，P<0.05）（3）BMSCs與NSCs共培養(yǎng)后分為兩組即空白對(duì)照組和BMP-4組，培養(yǎng)7天后可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)上已出現(xiàn)了明顯的分化，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)示細(xì)胞球向周邊呈

5、放射狀生長(zhǎng)，細(xì)胞間交織緊密，細(xì)胞間隙較窄。細(xì)胞免疫熒光染色可見(jiàn) GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞、MAP-2表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞以及 MBP表達(dá)陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞（4）提取細(xì)胞分化后的總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后確定WB的上樣量測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞分化后GFAP、MAP-2、MBP的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中 GFAP的表達(dá)量高于對(duì)照組（t=9.638,P<0.05），MBP的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(t=4.902,P<0.05)，MAP-2的表達(dá)無(wú)明顯