固化的金屬離子親和層析和質(zhì)譜聯(lián)用鑒定磷酸化多肽的策略優(yōu)化和快速老化小鼠脾淋巴細胞衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、一、固化的金屬離子親和層析和質(zhì)譜聯(lián)用鑒定磷酸化多肽的策略優(yōu)化
　　 可逆磷酸化是一種重要的細胞信號傳導(dǎo)模式，也是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達和功能的核心機制，因而參與調(diào)節(jié)了絕大多數(shù)的細胞生命活動。由于磷酸化蛋白質(zhì)的相對低豐度、負電性和相對的親水性，所以磷酸化蛋白質(zhì)或多肽的富集和提高質(zhì)譜儀的靈敏度就顯得十分重要。近年來，作為一種快速、簡單易用和經(jīng)濟的策略，固化的金屬離子親和層析技術(shù)(IMAC)被研究者廣泛地應(yīng)用于磷酸化多肽的富集。應(yīng)用該方法時，

2、研究者們把主要注意力放在如何降低那些含有酸性側(cè)鏈氨基酸(如谷氨酸和天門冬氨酸)的非磷酸化多肽對富集磷酸化多肽的影響上。然而，混在蛋白樣品中的核酸對于IMAC富集磷酸化多肽的影響卻未見報道。目前主要有兩種IMAC策略被應(yīng)用，一種需要甲酯化處理樣品的IMAC(ME-IMAC)策略和另一種不需要甲酯化處理樣品的IMAC(Non-ME-IMAC)策略。本項研究首先通過對兩種IMAC策略的比較實驗，證明ME-IMAC策略容易造成樣品丟失和增加質(zhì)譜

3、分析的復(fù)雜度，而Non-ME-IMAC策略才是更為簡單有效的磷酸化多肽富集策略。接著，我們對Non-ME-IMAC策略進行了較為細致的優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)理想的Non-ME-IMAC上樣/洗滌溶液是8％ACN/0.3％TFA，最理想的洗脫液是0.2mol/L磷酸氫銨(pH8.0)。另外，更為重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在強酸性條件(pH<1.9)下，IMAC介質(zhì)對核酸尤其是單鏈的或者包含單鏈區(qū)的核酸有很強的親和力，具有平端雙鏈的PCR-product則只具

4、有部分親和力。經(jīng)過進一步研究，我們首次指出對于核酸尤其是單鏈的或者包含單鏈區(qū)的核酸對采用IMAC策略富集磷酸化多肽有顯著的不良影響，對磷酸化多肽的信號抑制率超過70％。然后，我們找到了一種簡單有效的去除核酸，并能降低核酸對IMAC富集磷酸化多肽不良影響的方法--乙腈沉淀法。使用乙腈沉淀去除核酸的樣品與不去除核酸的樣品相比，磷酸化多肽的富集率可以提高2倍以上。本項研究為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了有價值的參考。
　　 二、快速老化

5、小鼠脾淋巴細胞衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究
　　 在動物和人中，衰老可引起許多功能退行性疾病，包括老年性癡呆、帕金森氏病及免疫功能失調(diào)等?？焖倮匣∈髮儆诮幌敌∈?，隨著月齡增加會出現(xiàn)許多與衰老相關(guān)的功能紊亂，其許多病理學(xué)特征與人類衰老時的病理學(xué)特征十分相似，因此，快速老化小鼠是一個很好的衰老動物模型。為了研究SAM鼠脾淋巴細胞中和衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)組，以9個月齡的SAMP8和SAMR1的脾淋巴細胞為材料，用雙向電泳分析脾淋巴細胞差別蛋