具細(xì)胞毒活性海洋微生物的分離篩選及次級(jí)代謝物研究.pdf

1、號(hào)稱第二號(hào)“殺手”的腫瘤疾病嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，對(duì)其仍無(wú)醫(yī)治良方。在治療癌癥方面，天然來(lái)源藥物發(fā)揮著重要的延年益壽作用。自20世紀(jì)40年代從一株點(diǎn)青霉(Penicilliumnotatum)中發(fā)現(xiàn)青霉素后，陸地微生物，尤其是鏈霉菌屬，因它們能產(chǎn)生豐富的且具有一定生物活性作用的次級(jí)代謝物而受到廣泛關(guān)注。經(jīng)過(guò)幾十年的大量開(kāi)發(fā)，從陸地微生物中開(kāi)發(fā)到新型次級(jí)代謝產(chǎn)物的幾率已大為降低，因此科學(xué)家們將目光投向了占陸地表面積達(dá)70％以上的海洋環(huán)

2、境，期待從中能開(kāi)發(fā)到具新型結(jié)構(gòu)的化合物。生活在海洋環(huán)境當(dāng)中的海洋微生物種類繁多，且因生存環(huán)境獨(dú)特(高壓、高鹽和高溫等)而能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的次級(jí)代謝物。因此，本論文開(kāi)展了從海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中篩選具細(xì)胞毒作用的先導(dǎo)化合物的研究工作。 本文對(duì)從海南島近海區(qū)采集的59個(gè)樣品，通過(guò)采用IM、GS、SC、GA、M1、YE、GN、HV、CZ和MT等10種分離培養(yǎng)基和加熱、SDS、苯酚、幾丁質(zhì)富集和YE富集等5種預(yù)處理方法，共分

3、離到1409株海洋微生物菌株，其中細(xì)菌962株，絲狀真菌168株，放線菌279株。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用加熱和SDS等2種預(yù)處理方法和GS、SC和YE等3種培養(yǎng)基有利于放線菌的分離。本研究對(duì)MTT法和稻瘟霉孢子法這兩種篩選模型對(duì)海洋微生物細(xì)胞毒活性菌株篩選的相關(guān)性進(jìn)行了比較，以確定出稻瘟霉孢子法能否作為本實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞毒藥物快速篩選方法。結(jié)果表明，當(dāng)采用稻瘟霉孢子法作初篩時(shí)，假陽(yáng)性率可達(dá)26.26％，且會(huì)漏篩掉一半以上的細(xì)胞毒活性菌株，因此不適合

4、作為細(xì)胞毒活性菌株的初篩模型。采用MTT法對(duì)篩選分離得到的1409株海洋微生物菌株的發(fā)酵液進(jìn)行了初步篩選后共獲得208株活性菌株，其中細(xì)菌的陽(yáng)性率為12.75％，放線菌為22.10％，真菌為14.29％。 在本研究中對(duì)分離獲得的對(duì)白血病細(xì)胞系K562具強(qiáng)細(xì)胞毒活性(ID50]1000)的3株鏈霉菌050642、060386和060524等菌株進(jìn)行了生理生化性狀的初步研究，結(jié)果表明3株菌遺傳穩(wěn)定性好，均有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。利用硅膠柱

5、層析、反相Ci8柱層析和SephadexLH-20等層析分離手段，通過(guò)活性跟蹤法對(duì)具強(qiáng)細(xì)胞毒活性的鏈霉菌菌株060524的次級(jí)代謝物進(jìn)行了分離，同時(shí)利用質(zhì)譜(ESI-MS或EI-MS)、核磁共振(1HNMR、13C-NMR、DEPT和NOED)等波譜技術(shù)對(duì)分離獲得的化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，共分離鑒定獲得了13個(gè)化合物，其中分離得到了大豆素、染料木素、3’-羥基大豆素、3’-羥基染料木素和benzaldehyde等5個(gè)具弱抗腫瘤活性的化合物

6、(20μg/ml≤IC50≤50μg/m1)；1-H-3-吲哚羧酸和1-H-3-吲哚羧酸甲酯等2個(gè)具中強(qiáng)細(xì)胞毒活性的化合物(10μg/ml≤IC50≤20μg/ml);anisomycin和deacetylanisomycin等2個(gè)具強(qiáng)細(xì)胞毒性的茴香霉素類抗腫瘤抗生素(IC50≤10μg/m1)。同時(shí)在90μg/ml的藥物作用濃度時(shí)，l-H-3-吲哚羧酸和deacetylanisomycin均顯示了細(xì)胞凋亡作用。 本文還對(duì)鏈霉菌