H-FABP死后診斷早期心肌梗死的免疫組化實驗性研究.pdf

1、SCD的研究是法醫(yī)病理學重要的任務之一，而AMI的死后診斷是法醫(yī)病理學的重點和難點。不足6h的心肌梗死死亡病例，其心肌在肉眼和光學顯微鏡下無特異性的改變，不使用特殊方法，難以對AMI引起的猝死作出早期的組織學診斷。在常規(guī)的組織學染色出現(xiàn)特征性的形態(tài)學改變以前，缺血心肌已經(jīng)發(fā)生了一系列的病理生理變化。生物化學，組織化學、酶組織化學、熒光組織化學染色，電子顯微鏡技術都能顯示心肌的早期損害，但是上述方法因操作過于復雜，缺乏特異性、穩(wěn)定性，費用

2、過高，以及易受到組織自溶、腐敗等因素的影響而限制了它們在法醫(yī)學中的應用。IHC作為一項快捷、簡便、實用的方法，它可以顯示缺血心肌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)和量的變化，從而為AMI死后診斷提供了一種可能。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白是一種小分子蛋白質(zhì)((14-15kDa)，且有嚴格的器官特異性，大量地存在于心肌細胞漿中，其作用是上調(diào)心肌細胞中的長鏈脂肪酸。具有分子量小、心肌細胞中含量高且為水溶性的特點，當心肌細胞缺血時，心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)很

3、容易迅速地透過細胞膜而漏出到細胞間質(zhì)，從而進入血液循環(huán)。大量的臨床研究證實心肌缺血12小時內(nèi)，用血液中脂肪酸結(jié)合蛋白的濃度診斷心肌梗死在特異性和敏感性方面都優(yōu)于肌紅蛋白，原因主要是脂肪酸結(jié)合蛋白的分子量較肌紅蛋白 (18kDa)小且有心臟特異性。因此心肌脂肪酸結(jié)合蛋白目前被世界衛(wèi)生組織列為新推薦的診斷急性心肌梗死的早期指標之一。用于心肌缺血引起猝死的死后診斷的IHC指標能否用于法醫(yī)病理學診斷，需要考慮其特異性和敏感性以外，還必須考慮組織

4、自溶、腐敗等因素對抗原的影響。因此用于心肌缺血引起猝死的死后診斷的各種IHC指標的死后穩(wěn)定性及其在死后不同時間的表達變化規(guī)律是值得進一步研究。 目的：本研究利用結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈前降支的方法建立動物心肌缺血模型，運用免疫組化的方法，探討H-FABP在死后診斷早期心肌梗死的敏感性及死后穩(wěn)定性，以期對其在法醫(yī)學中診斷SCD的應用價值進行評價。 實驗分為兩部分： 一.H-FABP在缺血心肌中的表達及敏感性研究方法：結(jié)扎大

5、鼠左側(cè)冠狀動脈前降支的方法建立大鼠心肌缺血模型，檢測H-FABP在大鼠心肌缺血不同時間的表達。45只健康SD大白鼠，重250-300克，雌雄不限，隨機分為8個實驗組和1個對照組，每組5只。對照組大白鼠除不結(jié)扎冠狀動脈外，其它步驟與實驗組完全相同。各實驗組大白鼠分別于結(jié)扎后15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時后處死，對照組大白鼠于手術后0小時處死.取出心臟放入10％中性緩沖福爾馬林液中固定24h。取材后作HE

6、染色和H-FABP免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察兩組標本的HE、IHC切片；并按IHC染色結(jié)果判定標準對IHC染色進行全面的觀察、判斷，采用圖像分析技術，客觀測量IHC切片中H-FABP的缺失面積和陽性面積。結(jié)果： 1.常規(guī)HE染色：對照組及心肌缺血3h以內(nèi)組，心肌細胞染色清晰、邊界清楚、橫紋存在，僅見有輕度心肌間質(zhì)水腫。心肌缺血4h后缺血區(qū)可見少許心肌細胞輕度水腫，缺血區(qū)邊緣有少許炎性細胞浸潤、心肌嗜伊紅性增強，未見明顯的細胞

7、壞死。心肌缺血8h可見心肌嗜伊紅性明顯增強，部分心肌細胞出現(xiàn)凝固性壞死，炎性細胞增多。 2.免疫組織化學染色：對照組心肌胞漿全部染成均勻的棕黃色，用蘇木素襯染后，細胞核染成淡藍色，心肌細胞間質(zhì)及其他細胞成分不著色。實驗組心肌細胞H-FABP在缺血心肌內(nèi)的脫失表達具有明顯的時間規(guī)律。缺血15分鐘組，在心內(nèi)膜下心肌、乳頭肌可見散在或小灶性的部分H-FABP缺失。缺血30分鐘組，開始出現(xiàn)脂肪酸結(jié)合蛋白的完全脫失，但仍然局限于心肌內(nèi)膜下

8、和乳頭肌。缺血1小時和2小時組的心肌則出現(xiàn)斑片狀缺失且波及到心肌中層，缺血3小時累及心肌外層。缺血4小時，心肌細胞則出現(xiàn)全層細胞的完全脫失并隨著缺血時間的延長，脫失面積增大。H-FABP在心肌缺血不同時間的各組缺失面積經(jīng)比較和統(tǒng)計學分析表明：實驗組的H-FABP缺失面積與其各相應對照組比較均有顯著性差異，H-FABP在缺血3小時內(nèi)各組之間沒有明顯的差異性，而心肌缺血3小時與心肌缺血4小時的心肌細胞中H-FABP脫失面積仍有顯著差異，說明

9、H-FABP的敏感性主要體現(xiàn)在心肌缺血3h以前。 二.H-FABP在診斷早期心肌梗死的死后穩(wěn)定性的實驗性 研究方法：結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈前降支的方法建立家兔心肌梗死3小時模型，檢測H-FABP在死后不同時間的表達情況。20只健康新西蘭大白兔，體重2-2.5kg，雌雄不限，隨機分為實驗組(B組n=10)和對照組(A組n=10)。實驗組予以結(jié)扎左冠狀動脈前降支造成心肌缺血持續(xù)3小時后斷頸處死，取缺血區(qū)心??；對照組除不結(jié)扎冠狀動脈

10、外，其它步驟與實驗組完全相同。術后0時直接處死，取左心室心肌。兩組標本在4℃放置，分別于死后1h、2h、4h、8h、16h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、10d、2w、取材作HE染色和H-FABP免疫組化染色。觀察兩組標本的HE切片；并按IHC染色結(jié)果判定標準對IHC染色進行全面的觀察、判斷，采用圖像分析技術，客觀測量IHC切片中H-FABP的缺失面積和陽性表達強度。 結(jié)果： 1.常規(guī)HE染色：缺血心肌組織可

11、見細胞濁腫、水樣變，橫紋模糊或消失，胞漿灶性嗜伊紅性增強、胞核縮小而染色加深，心肌纖維波浪樣改變等心肌早期缺血的病理改變，未見典型心肌梗死改變。缺血心肌4℃放置3-4天，心肌結(jié)構(gòu)部分改變?nèi)缧募〖毎麧崮[、橫紋模糊或消失與正常心肌死后變化相似，缺乏特異性。放置7-14天，缺血心肌組織和細胞形態(tài)與對照組類似。 2.免疫組織化學染色：對照組心肌組織在4℃放置3d內(nèi)，H-FABP在心肌細胞胞漿內(nèi)呈強陽性表達，未見明顯的脫失區(qū)；4℃放置4d

12、心肌內(nèi)膜下出現(xiàn)部分小片狀缺失。缺血區(qū)心肌組織均可見不規(guī)則點、灶、片狀H-FABP缺失區(qū)；部分區(qū)域心肌細胞H-FABP陽性表達強度減弱。連續(xù)HE染色對比發(fā)現(xiàn)H-FABP缺失區(qū)及陽性表達減弱區(qū)的心肌細胞胞漿嗜伊紅性增強、細胞核縮小而染色加深。梗死區(qū)與非梗死交界區(qū)域的心肌細胞內(nèi)H-FABP陽性表達強度減弱與周圍陽性表達的非缺血區(qū)心肌分界清楚。H-FABP在在對照組及心肌梗死組不同時間的缺失面積兩兩比較和統(tǒng)計分析表明：4℃放置3d內(nèi)H-FABP

13、陽性表達強度無明顯減弱，缺失面積無增加；隨著兩組標本在4℃放置時間的延長，H-FABP陽性表達強度和陽性反應面積有減弱趨勢。死后放置4d以內(nèi)H-FABP脫失面積與相應正常對照組有顯著性差異(p＜0.05)，放置超過5d以上，其脫失面積與正常對照組無顯著性差異(p＞0.05)。結(jié)論： 1.大鼠心肌缺血后15min即可出現(xiàn)H-FABP脫失，隨著缺血時間的延長，心肌細胞內(nèi)H-FABP的缺失面積增加，心肌缺血4小時達到高峰。H-FABP