一群新的CD44high CD58high大腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性鑒定及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　大腸癌是常見消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居常見腫瘤第3位，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是大腸癌致死主要原因，深入研究大腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有助于改善大腸癌臨床預(yù)后。大腸癌腫瘤干細(xì)胞是大腸癌組織中一小部分增殖緩慢、具有自我更新和多向分化能力的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，在大腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和治療抵抗中起重要作用。自我更新是大腸癌干細(xì)胞的主要特征，也是其上述惡性生物學(xué)行為的根源。Wnt、Notch、Hedgehog、TGF-β、PI3K/A

2、kt等通路參與了大腸癌干細(xì)胞自我更新的調(diào)控，其中Wnt通路對(duì)大腸癌干細(xì)胞自我更新的維持起支配性作用。
　　腫瘤干細(xì)胞具有多個(gè)干性相關(guān)細(xì)胞表面分子標(biāo)志物，用于腫瘤干細(xì)胞鑒定和分選。目前已發(fā)現(xiàn)大腸癌干細(xì)胞具有多個(gè)表面分子標(biāo)志包括CD133、CD44、CD24等，標(biāo)記具有不同生物學(xué)功能的干細(xì)胞亞群，新的大腸癌干細(xì)胞分子標(biāo)志有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。這些分子標(biāo)志與自我更新的調(diào)控關(guān)系是目前研究熱點(diǎn)，如CD44對(duì)大腸癌干細(xì)胞自我更新具有促進(jìn)作用，然而其

3、他分子標(biāo)志是否或如何參與調(diào)控自我更新尚不明確。另外，表面分子標(biāo)志也可通過與大腸癌局部微環(huán)境中免疫細(xì)胞表面配體或受體相互作用而影響自我更新，其具體機(jī)制尚待研究。因此，大腸癌干細(xì)胞表面分子標(biāo)志與自我更新調(diào)控關(guān)系的研究不僅可進(jìn)一步闡明腫瘤干細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，也可為靶向清除大腸癌干細(xì)胞提供新的治療靶點(diǎn)和研究思路。
　　目的:
　　本研究主要以大腸癌HT29、SW620細(xì)胞系和原代大腸癌P1細(xì)胞系為研究對(duì)象，篩選和鑒定

4、大腸癌干細(xì)胞新的表面分子標(biāo)志;檢測和鑒定新發(fā)現(xiàn)的CD44highCD58high大腸癌干細(xì)胞表達(dá)水平及其腫瘤干細(xì)胞特征;研究新的表面標(biāo)志分子CD58在大腸癌干細(xì)胞中分子生物學(xué)功能及其作用機(jī)制;初步探究Snail/CXCL-8軸對(duì)CD44highCD58high大腸癌干細(xì)胞干性特征影響及其調(diào)控機(jī)制，從而闡明CD44highCD58high大腸癌干細(xì)胞的惡性生物學(xué)功能。
　　方法:
　　通過體外無血清低粘附培養(yǎng)富集大腸癌干細(xì)胞，

5、采用全基因cDNA表達(dá)譜芯片篩選其中差異表達(dá)CD分子作為候選干細(xì)胞標(biāo)志物，以免疫熒光檢測驗(yàn)證。流式細(xì)胞術(shù)檢測大腸癌細(xì)胞系和原代大腸癌組織中CD44highCD58high大腸癌細(xì)胞表達(dá)水平。采用克隆球形成試驗(yàn)、動(dòng)物連續(xù)致瘤實(shí)驗(yàn)和化療藥物富集試驗(yàn)等鑒定CD44highCD58high大腸癌細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特征，并評(píng)價(jià)其與已知大腸癌干細(xì)胞亞群之間的關(guān)系。為研究CD58對(duì)自我更新的調(diào)控作用，采用熒光素酶雙報(bào)告基因法檢測過表達(dá)或激活CD58對(duì)W

6、nt通路活性影響，同時(shí)利用慢病毒轉(zhuǎn)染觀察沉默CD58對(duì)體外克隆球形成和體內(nèi)移植瘤形成的影響。結(jié)合cDNA表達(dá)譜芯片分析、免疫共沉淀、western blot及克隆球形成實(shí)驗(yàn)等鑒定CD58上調(diào)Wnt通路活性的作用靶蛋白。采用熒光素酶報(bào)告基因和western blot檢測Snail對(duì)CD44和CD58轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響，并觀察CXCL-8對(duì)體外克隆形成的影響，初步研究Snail/CXCL-8軸對(duì)這群細(xì)胞干性特征的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:<

7、br>　　1、大腸癌干細(xì)胞CD44和CD58表達(dá)升高，CD44highCD58high大腸癌細(xì)胞具有顯著腫瘤干細(xì)胞特征。
　　基因芯片篩選結(jié)果示CD44和CD58在大腸癌干細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，對(duì)大腸癌細(xì)胞系和19例原代大腸癌組織流式細(xì)胞檢測結(jié)果示CD44highCD58high大腸癌細(xì)胞普遍存在，其表達(dá)水平為0.5～10.0％。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果示CD44highCD58high大腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外克隆球形成、動(dòng)物體內(nèi)致瘤和上皮間

8、充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，且體內(nèi)外均可被化療藥物5-FU和奧沙利鉑短期作用顯著富集，提示CD44highCD58high大腸癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性。
　　2、CD44highCD58high大腸癌細(xì)胞是CD133+細(xì)胞的一個(gè)亞群。
　　對(duì)大腸癌細(xì)胞系、原代大腸癌組織和大腸癌腫瘤克隆球行流式細(xì)胞檢測結(jié)果示CD133+大腸癌細(xì)胞中CD44highCD58high細(xì)胞比例顯著高于CD133-大腸癌細(xì)胞(P＜0.05)，提示CD44highC

9、D58high大腸癌細(xì)胞是CD133+細(xì)胞的一個(gè)亞群。而CD44highCD58high細(xì)胞與CD44+CD24+細(xì)胞分布重合率很低，無重疊分布。
　　3、CD58能上調(diào)Wnt通路活性而促進(jìn)大腸癌腫瘤干細(xì)胞特征和自我更新。
　　熒光素酶雙報(bào)告基因方法檢測結(jié)果示瞬時(shí)過表達(dá)CD58后大腸癌細(xì)胞Wnt通路活性上調(diào)，使用CD58交聯(lián)抗體TS2/9或CD58受體重組人CD2分子作用大腸癌細(xì)胞激活CD58也能上調(diào)Wnt通路活性，體外實(shí)驗(yàn)

10、示克隆球形成能力增加。使用慢病毒感染成功構(gòu)建CD58穩(wěn)定抑制細(xì)胞，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果示沉默CD58導(dǎo)致克隆球形成減少并顯著抑制體內(nèi)移植瘤成瘤率和生長速度。
　　4、大腸癌中CD58通過結(jié)合并降解Dickkopf3上調(diào)Wnt通路活性。
　　免疫共沉淀結(jié)果示CD58能與Dickkopf3(Dkk-3)結(jié)合，瞬時(shí)過表達(dá)CD58后Dkk-3出現(xiàn)降解現(xiàn)象。熒光素酶雙報(bào)告基因檢測結(jié)果示大腸癌細(xì)胞過表達(dá)Dkk-3抑制Wnt通路活性，構(gòu)建Dkk

11、-3穩(wěn)定抑制大腸癌細(xì)胞后再過表達(dá)CD58，Wnt通路活性不能上調(diào)，提示CD58與Wnt通路負(fù)性調(diào)控因子Dkk-3結(jié)合并導(dǎo)致其降解，從而上調(diào)Wnt通路活性而促進(jìn)自我更新。
　　5、Snail/CXCL-8軸與CD44、CD58和大腸癌干細(xì)胞自我更新存在調(diào)控關(guān)系。
　　Western blot結(jié)果示轉(zhuǎn)錄因子Snail在CD44+大腸癌細(xì)胞表達(dá)增加，瞬時(shí)過表達(dá)Snail后CD58表達(dá)增加同時(shí)熒光素酶活性檢測結(jié)果示Snail調(diào)控CD

12、58的轉(zhuǎn)錄。ELISA結(jié)果示CD58與T淋巴細(xì)胞表面CD2相互作用促進(jìn)CXCL-8分泌，體外實(shí)驗(yàn)示CXCL-8可促進(jìn)大腸癌體外克隆球形成能力。
　　結(jié)論:
　　CD44highCD58high大腸癌細(xì)胞是一群新的大腸癌干細(xì)胞，CD58是一個(gè)新的參與調(diào)控大腸癌干細(xì)胞自我更新的分子標(biāo)志。激活CD58通過結(jié)合和降解Dkk-3上調(diào)Wnt/β-catenin通路活性進(jìn)而促進(jìn)大腸癌干細(xì)胞自我更新。Snail/CXCL-8軸對(duì)CD44hi