香魚CXCL8樣蛋白的分子克隆及功能分析.pdf

1、CXCL8是一種 CXC型趨化因子，是動物免疫應(yīng)答調(diào)控體系的重要組分之一。CXCL8可以由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，例如，在哺乳動物中它可以由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等分泌產(chǎn)生。它可由細(xì)胞因子白介素1β（IL-1β)和腫瘤壞死因子α（TNF-α)誘導(dǎo)表達(dá)。CXCL8對巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞等細(xì)胞有趨化作用。本研究克隆了香魚 CXCL8(PaCXCL8l)基因的cDNA序列，它由872個核苷酸組成，編碼一個由

2、95個氨基酸組成的、分子量為10.41 kDa的目的蛋白。它的基因組DNA序列由1277個核苷酸組成，包括四個外顯子和三個內(nèi)含子。PaCXCL8l與已知的魚類 CXCL8結(jié)構(gòu)相似，N端19個殘基為信號肽序列。序列對比表明，PaCXCL8l與大西洋鱈魚的CXCL8氨基酸相似性最高，為83％。熒光定量 P C R檢測發(fā)現(xiàn)，健康香魚的PaCXCL8l的mRNA主要在頭腎和脾組織中表達(dá)，此外 PaCXCL8l在體外培養(yǎng)的頭腎來源的單核巨噬細(xì)胞也

3、有高表達(dá)。鰻利斯頓氏菌感染以后，PaCXCL8l在肝、腦、鰓、頭腎、心、脾和單核巨噬細(xì)胞均表達(dá)上調(diào)。隨后原核表達(dá)了PaCXCL8l，用 Ni2+親和柱純化PaCXCL8l蛋白，利用尿素梯度稀釋法復(fù)性蛋白，制備小鼠多抗。Western blot檢測發(fā)現(xiàn) PaCXCL8l蛋白在鰻利斯頓氏菌感染后的香魚單核巨噬細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。進(jìn)而研究純化復(fù)性的PaCXCL8l蛋白對中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的趨化效果，發(fā)現(xiàn) PaCXCL8l蛋白可趨化中性粒細(xì)胞和

4、單核巨噬細(xì)胞，分別在0.1μg/ml和1.0μg/ml達(dá)到最大趨化效果。隨后，香魚腹腔注射 PaCXCL8l蛋白，可有效增加腹腔中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的數(shù)量。此外，PaCXCL8l蛋白體外處理中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞 IL-1β、TNF-α和IL-10三種細(xì)胞因子均表達(dá)上調(diào)。通過上述實(shí)驗(yàn)，我們明確 PaCXCL8l蛋白通過對嗜中性粒細(xì)胞作用，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。該工作為進(jìn)一步深入研究 CXCL8在魚類抗細(xì)菌免疫