微重力條件下CKIP-1基因?qū)π∈蠊撬栝g充質(zhì)干細胞增殖及向成骨分化影響研究.pdf

1、目的：隨著我國太空事業(yè)的發(fā)展，宇航員太空活動增多，駐留時間延長，因失重導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松現(xiàn)象加重。同時隨著我國社會老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松患者逐漸增多，給患者帶來嚴重的健康問題和經(jīng)濟負擔(dān)。CKIP-1(酪氨酸激酶相關(guān)蛋白酶1)基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的骨分化、形成的負調(diào)控因子，能夠有效對抗失重性及廢用性骨質(zhì)疏松。本文主要探索微重力環(huán)境下，CKIP-1基因?qū)π∈驜MSCs細胞增殖、凋亡及成骨分化的影響及分子機制探討研究，為治療骨質(zhì)疏松找到新的方法。<

2、br>　　方法：
　　1、敲除CKIP-1基因的BMSCs（knockout，KO-BMSCs）及正常BMSCs細胞提?。篊KIP-1基因小鼠和野生型小鼠雜交繁育后，PCR法鑒定4周齡敲除CKIP-1基因小鼠（Knockout,KO型）與野生型C57BL/6小鼠(wildtype，WT型)，股骨離斷用全骨髓法提取兩組BMSCs細胞，傳代培養(yǎng)，分離，純化。觀察細形態(tài)，胞流式細胞學(xué)鑒定純度。并用細胞計數(shù)法及MTT法檢測正常重力下CKI

3、P-1對細胞增殖影響。
　　2、將BMSCs細胞（KO-BMSCs及WT-BMSCs）分別在不同重力環(huán)境中培養(yǎng)。細胞分為4組分為：①野生型BMSCs細胞正常重力組（wildtype–normalgravity，WT-NG）；②敲除CKIP-1型BMSCs細胞正常重力組(knockout–normalgravity,KO-NG);③敲除CKIP-1型BMSCs細胞微重力組（knockout–microgravity，KO-MG）④野

4、生型BMSCs細胞微重力組（wildtype–microgravity,WT-MG）。微重力環(huán)境用體外細胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）模擬，均在體外行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后行相關(guān)檢測。
　　3、細胞增殖及成骨分化相關(guān)指標(biāo)檢測
　　3.1MTT測量細胞0、3、5天細胞的增殖
　　3.2流式細胞學(xué)技術(shù)及RT-PCR測定Bcl-2基因表達分析各組細胞的凋亡
　　3.3茜素紅染色檢測各組細胞的礦化程度
　　3.4細胞微絲染

5、色
　　3.5細胞堿性磷酸酶（ALP）濃度測定及染色
　　3.6RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達
　　3.7Westernblot檢測成骨相關(guān)蛋白的表達
　　結(jié)果：
　　1、敲除CKIP-1基因后，小鼠的生命體征及生長發(fā)育未受明顯影響。KO-BMSCs細胞和WT-BMSCs在體外可以正常增殖生長。通過傳代培養(yǎng)4代后BMSCs純度可達90％以上。細胞計數(shù)顯示KO-BMSCs增殖率低于WT-BMSCs組，MT

6、T試驗結(jié)果顯示二者之間未有明顯統(tǒng)計學(xué)意義；
　　2.微重力條件抑制細胞增殖及BMSCs向成骨細胞的分化；微重力環(huán)境促進細胞凋亡，敲除CKIP-1基因促進了細胞的凋亡；
　　3.微重力環(huán)境中BMSCs細胞由梭形變?yōu)閳A形，WT-BMSCs形態(tài)變化較KO-BMSCs組弱。同時在微重力條件下兩組BMSCs細胞的微絲變細，排列紊亂，但敲除CKIP-1基因能有效對抗微絲變化，保持微絲形態(tài)；
　　4.敲除CKIP-1基因后BMSCs

7、細胞成骨分化能力增強，BMP/Smad信號通道表達增強，成骨相關(guān)基因及蛋白的表達增強，而微重力環(huán)境中該趨勢受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1、敲除CKIP-1后小鼠的生命體征及生長發(fā)育未受明顯影響，敲除CKIP-1基因后小鼠BMSCs增殖率降低；
　　2、敲除CKIP-1后BMSCs細胞增值率降低，但敲除CKIP-1基因能有效對抗微重力阻礙BMSCs向成骨細胞分化的效應(yīng)，促進細胞的成骨分化，可以為治療骨質(zhì)疏松治療提供新的思