單抗CD44-生物素-親和素綁定技術(shù)用于軟骨組織工程的效果研究.pdf

1、第一部分
　　 單抗CD44-生物素-親和素綁定技術(shù)
　　 提高軟骨細胞與殼聚糖無孔膜黏附力的實驗研究
　　 目的：考察單抗CD44-生物素(Biotin)-親和素(Avidin)綁定技術(shù)(CBA技術(shù))能否在構(gòu)建的軟骨細胞二維培養(yǎng)體系中提高軟骨細胞與殼聚糖無孔膜表面的黏附能力。
　　 方法：軟骨細胞分離培養(yǎng)及鑒定，制備殼聚糖無孔膜。制備軟骨細胞二維培養(yǎng)體系，分3組：A.殼聚糖無孔膜+軟骨細胞(常規(guī)組)；B

2、.生物素+親和素化殼聚糖無孔膜+軟骨細胞(BA技術(shù)組)；C.生物素化單抗CD44+親和素化殼聚糖無孔膜+軟骨細胞(CBA技術(shù)組)。分別在細胞種植后的1h、2h、4h、12 h和24 h，用相差顯微鏡對細胞的生長黏附情況進行照相分析，并利用圖像軟件對各組細胞的展平面積測定并統(tǒng)計，分析軟骨細胞對殼聚糖無孔膜表面的黏附能力。
　　 結(jié)果：C組的大部分細胞在接種后1h就已經(jīng)張開并展平，而B組和A組細胞則分別需要2h和12 h才能達到大致

3、相同的形狀。C組細胞的展平面積明顯大于B組和A組。接種后4h，25％的C組細胞的面積達到1500-2000μm2，而B組同期只有15％，A組則要到24 h后才能達到15％。各組展平面積隨時間延長遞增，各時間點平均展平面積C組>B組>A組，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：Biotin-Avidin綁定技術(shù)能比常規(guī)接種方法提高軟骨細胞與殼聚糖無孔膜黏附能力，但是相比而言，單抗CD44-Biotin-Avidin綁

4、定技術(shù)對于軟骨細胞粘附能力的提高更加顯著。
　　 第二部分
　　 單抗CD44-生物素-親和素綁定技術(shù)
　　 提高軟骨細胞與殼聚糖三維支架黏附力及體外構(gòu)建組織工程軟骨的實驗研究
　　 目的：觀察單抗CD44-生物素(Biotin)-親和素(Avidin)綁定技術(shù)在構(gòu)建的軟骨細胞三維培養(yǎng)體系中能否提高軟骨細胞與殼聚糖支架的黏附能力，在體外構(gòu)建的組織工程軟骨(Tissue engineering cartil

5、age，TEC)能否促進軟骨細胞的增殖和軟骨細胞表型的表達。
　　 方法：制備軟骨細胞三維培養(yǎng)體系，分3組：A.殼聚糖三維支架+軟骨細胞(常規(guī)組)；B.生物素+親和素化殼聚糖三維支架+軟骨細胞(BA技術(shù)組)；C.生物素化單抗CD44+親和素化殼聚糖三維支架+軟骨細胞(CBA技術(shù)組)。軟骨細胞接種后分別用細胞計數(shù)儀計數(shù)脫落細胞，測定接種細胞脫落率；MTT法生長曲線測定殼聚糖支架內(nèi)軟骨細胞增殖率；掃描電鏡觀察細胞支架復(fù)合體上細胞生長

6、情況；生物化學(xué)檢測TEC內(nèi)的DNA和GAG含量；組織學(xué)切片觀察TEC內(nèi)軟骨細胞的增殖和胞外基質(zhì)的表達情況；RT-PCR法檢測Ⅱ型膠原(ColⅡ)、aggrecan、sox9的mRNA表達。
　　 結(jié)果：細胞接種脫落率：A組為C組的3.71倍，為B組的2.17倍，而B組為C組的1.71倍，A組>B組>C組(P<0.05)。掃描電鏡見C組細胞數(shù)量較多，成分散狀，分布較均勻；A組細胞數(shù)量很少，成聚集狀，分布很不均勻；B組所見介于C與A

7、組間。組織切片顯示細胞在支架內(nèi)C組增殖旺盛，胞外基質(zhì)表達較豐富；A組增殖較弱，胞外基質(zhì)表達較弱；B組介于C與A組間。DNA和GAG含量，細胞增殖率及ColⅡ、aggrecan、sox9的mRNA表達量表現(xiàn)為：C組>B組>A組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：單抗CD44-Biotin-Avidin綁定技術(shù)能比Biotin-Avidin綁定技術(shù)更顯著的提高軟骨細胞與支架的黏附能力，并更有助于促進TEC種子細胞的增殖和軟骨細胞表型的表

8、達。
　　 第三部分
　　 單抗CD44-生物素-親和素綁定技術(shù)
　　 構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的效果研究
　　 目的：觀察單抗CD44-生物素(Biotin)-親和素(Avidin)綁定技術(shù)，在體外構(gòu)建的組織工程軟骨移植修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的效果。
　　 方法：如第二部分所述分3組構(gòu)建組織工程軟骨。軟骨細胞接種后測定接種細胞脫落率；Real-time PCR法檢測組織工程

9、軟骨Ⅱ型膠原(ColⅡ)、aggrecan及sox9的mRNA表達。分4組修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨全層缺損：A組植入殼聚糖支架+軟骨細胞(常規(guī)組)；B組植入BA技術(shù)構(gòu)建的組織工程軟骨(BA技術(shù)組)；C組植入CBA技術(shù)構(gòu)建的組織工程軟骨(CBA技術(shù)組)；D組植入自體軟骨(自體組)。12、24周后取出標(biāo)本行大體觀察并行Moran評分；生物力學(xué)方法評估標(biāo)本彈性模量和剛度；免疫印跡(Western blot)檢測新生軟骨組織內(nèi)的colⅡ、aggr

10、ecan目的蛋白含量；對標(biāo)本行組織學(xué)HE染色、甲苯胺藍染色和免疫組織化學(xué)染色并行Wakitani組織學(xué)評分。
　　 結(jié)果：細胞接種脫落率：A組>B組>C組(P<0.05)；ColⅡ、aggrecan及sox9的mRNA表達量：C組>B組>A組(P<0.05)；12、24周時Moran大體評分，得分越高則修復(fù)效果越好：D組>C組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，C組>B組>A組(P<0.05)；12、24周時生物力學(xué)檢測彈性模量和

11、剛度、Western blot檢測colⅡ、aggrecan目的蛋白含量結(jié)果皆為：D組>C組>B組>A組(P<0.05)；組織切片顯示C、D組修復(fù)效果相似，都較好，見大量成熟軟骨細胞且基質(zhì)分布均勻，而A組修復(fù)效果較差，成熟軟骨細胞數(shù)量少且基質(zhì)分布不夠均勻，B組所見則介于A、C兩組間；12、24周時Wakitani組織學(xué)評分，得分越低則修復(fù)效果越好：D組0.05)，C組