生物素-親和素-酶聯(lián)免疫分析測(cè)定人血小板膜糖蛋白功能的方法建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、研究背景:
　　 血栓形成是心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要病理機(jī)制,而血小板在血栓形成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。血小板通過(guò)血小板膜糖蛋白實(shí)現(xiàn)粘附、聚集和活化反應(yīng)等功能。已知血小板P-選擇素(CD62p)和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)在血小板膜上的表達(dá)量的增加可以作為血小板活化的特異性指標(biāo)。在一些血栓性疾病中,如心血管疾病、腦血管疾病、糖尿病中,血小板常呈現(xiàn)活化狀態(tài)。測(cè)定血小板膜糖蛋白表達(dá)水平可以了解血小板的活化狀態(tài)。目前,常用電泳

2、法、放免法和流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)血小板膜糖蛋白,但均有不足之處。本研究采用抗血小板膜糖蛋白的單克隆抗體包板,以生物素.親和素.酶聯(lián)免疫反應(yīng)(BA-ELISA)測(cè)定血小板膜糖蛋白功能。該方法的建立將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)BA-ELISA方法檢測(cè)血小板膜糖蛋白功能的空白,易于在臨床推廣應(yīng)用,將具有較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
　　 目的:
　　 (1)應(yīng)用單克隆抗體和生物素-親和素系統(tǒng)建立生物素-親和素-酶聯(lián)免疫分析方法,并對(duì)其靈敏度、批內(nèi)和批間差

3、異等方法學(xué)考核。
　　 (2)該方法應(yīng)用于臨床標(biāo)本(急性心肌梗死、急性腦梗死和糖尿病患者等)檢測(cè)并評(píng)價(jià)臨床實(shí)用價(jià)值。
　　 方法:
　　 應(yīng)用抗血小板CD62p單抗SZ51和抗血小板GPⅡb/Ⅲa單抗7E3分別包板,加入經(jīng)ADP誘導(dǎo)的或未誘導(dǎo)的正常人富含血小板血漿(PRP),以生物素標(biāo)記的抗GPⅠⅡⅢb單抗SZ2(Biotin-SZ2)反應(yīng)后,加入親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(Avdin-HRP)檢測(cè),鄰苯二胺(O

4、PD)顯色后,酶標(biāo)儀讀取吸光度值(OD)。對(duì)其靈敏度,批內(nèi)、批間差異作方法學(xué)評(píng)估,并應(yīng)用該方法對(duì)抑制性單抗SZ21和阿司匹林抑制血小板活化的功能效果測(cè)定,并與流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行比較。應(yīng)用該方法分析急性心肌梗死患者(AMI)、急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)患者、糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者及正常人的血小板膜上的CD62p和GPⅡb/Ⅲa的水平,并與流式細(xì)胞術(shù)(FCM

5、)作比較。
　　 結(jié)果:
　　 (1)靈敏度:該方法可檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)低達(dá)6.25×109/L(SZ51包被板)和3.13×109/L(7E3包被板)的標(biāo)本。
　　 (2)重復(fù)性:該方法測(cè)定血小板膜的CD62p OD值的批內(nèi)差異和批間差異分別為4.38％和6.23％(n=10)；GPⅡb/Ⅲa的OD值的批內(nèi)差異和批間差異分別為5.78％和6.96％(n=10)。
　　 (3)方法學(xué)比較:本法和流式細(xì)胞儀同時(shí)

6、測(cè)定正常人和患者的CD62p和GPⅡb/Ⅲa水平。結(jié)果經(jīng)直線回歸分析得r=0.86,可見(jiàn)兩方法有較好的相關(guān)性。
　　 (4)血小板聚集抑制實(shí)驗(yàn):設(shè)SZ21抑制組、阿司匹林抑制組和對(duì)照組。BA-ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在體外ADP誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)中,SZ21和阿司匹林可明顯抑制血小板的活化,且其抑制作用呈劑量依賴(lài)性。
　　 (5)臨床應(yīng)用:應(yīng)用本法測(cè)定30例AMI、30例ACI、30例DM患者和50例正常人的ADP誘導(dǎo)

7、的(未誘導(dǎo)的)血小板的CD62p和GPⅡb/Ⅲa的OD值。其分別為1.76±0.56(0.72±0.25),1.95±0.53(1.53±0.61)；1.51±0.14(0.61±0.16),1.88±0.42(1.46±0.57)和1.38±0.26(0.43±0.21),1.61±0.42(1.23±0.32),顯著高于正常人0.68±0.21(0.18±0.09)和0.87±0.29(0.44±0.14)(P<0.01)。同時(shí)與F

8、CM方法檢測(cè)血小板膜表面CD62p和GPⅡb/Ⅲa表達(dá)情況作比較,結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:
　　 (1)首先在國(guó)內(nèi)建立了人血小板膜糖蛋白功能測(cè)定的BA-ELISA檢測(cè)方法。
　　 (2)該方法敏感性好、特異性高、重復(fù)性好。
　　 (3)該方法可以測(cè)定血小板功能活化劑或抑制劑對(duì)血小板功能影響,有助于抗血小板藥物篩選、臨床用藥指導(dǎo)和藥物監(jiān)測(cè)；可以測(cè)定血栓性疾病或血栓形成相關(guān)性疾病引起的血小板活化程度,有助于反