四十年跨度61012例食管癌生存分析和MHC區(qū)域SNP關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、1、研究背景和目的：
　　世界范圍內(nèi)，食管癌死亡人數(shù)位居惡性腫瘤第六位；在我國(guó)，食管癌是第四位癌癥死亡原因；我國(guó)是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家，全世界每年一半以上的新發(fā)和死亡患者均發(fā)生在中國(guó)。食管癌預(yù)后較差，5年生存率僅20％左右。雖然各種治療方式進(jìn)展迅速，但食管癌生存率多年來(lái)一直處于較低水平。早期食管癌預(yù)后很好，但臨床上90%以上患者確診時(shí)已是中晚期。中晚期食管癌生存狀況普遍較差，但仍有部分患者可以長(zhǎng)期生存十年以上，有些可達(dá)三

2、十年以上。到底有哪些原因?qū)е率彻馨┗颊咴谕瑯拥腡NM分期而其生存期確有如此大的不同？研究者較一致的看法是環(huán)境和遺傳交互作用的結(jié)果。如何找出影響患者生存期的原因、提高患者生存率是每位癌癥研究工作者的使命，也是眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一。
　　本研究在大樣本量流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)之上進(jìn)行大規(guī)模生存期隨訪(fǎng)，試圖通過(guò)生存分析找出生存期的影響因素，為臨床食管癌防治提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)。
　　食管癌極強(qiáng)的地域性分布差異和顯著的家族聚集現(xiàn)象

3、提示環(huán)境和遺傳因素均在其發(fā)病機(jī)制中起重要作用。有研究提示免疫防御機(jī)制在食管癌變過(guò)程中可能起到重要的作用；而人類(lèi)的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是與自身免疫密切相關(guān)的重要區(qū)域；本研究組前期的中國(guó)人食管鱗癌全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）共計(jì)發(fā)現(xiàn)了10個(gè)食管鱗癌易感單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide po

4、lymorphism，SNP）位點(diǎn)和8個(gè)相關(guān)易感基因；本研究組前期揭示了3個(gè)MHC區(qū)域的SNP和食管鱗癌相關(guān)，但未進(jìn)行另外獨(dú)立樣本的驗(yàn)證。本研究是在前期基礎(chǔ)之上，為了評(píng)估免疫因素對(duì)食管癌發(fā)病的影響，進(jìn)一步擴(kuò)大了樣本量，進(jìn)行了MHC區(qū)域的食管癌GWAS研究，即經(jīng)GWAS研究篩選出在MHC區(qū)域與食管鱗癌發(fā)病可能有關(guān)的SNP位點(diǎn)，并對(duì)這些SNP位點(diǎn)在另外獨(dú)立的樣本進(jìn)行TaqMan驗(yàn)證，進(jìn)而確定在MHC區(qū)域與食管鱗癌高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的SNP位點(diǎn)。

5、r>　　2、材料及方法：
　　2.1食管癌大樣本生存分析
　　2.1.1研究對(duì)象
　　鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合多家醫(yī)院和科研院所進(jìn)行食管癌大規(guī)模隨訪(fǎng)調(diào)查，采用現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研、腫瘤登記、醫(yī)院核查和電話(huà)隨訪(fǎng)等方式收集患者資料。收集到40年跨度（1974-2013年）的食管癌患者資料共計(jì)61012例，隨訪(fǎng)截止日期是2014年7月24日。
　　1）研究對(duì)象的一般情況：
　　在生存期明確的6101

6、2例患者中，男38289例，最小年齡是15歲，最大年齡是104歲，平均年齡是59.876±9.480歲；女22723例，最小年齡是24歲，最大年齡是99歲，平均年齡是60.548±9.513歲。
　　2）研究對(duì)象的病理診斷
　　在收集到患者的一般信息之后，即到各家患者診治醫(yī)院進(jìn)行臨床信息和病理資料的核對(duì)，記錄下患者詳實(shí)的食管癌組織學(xué)類(lèi)型、大體類(lèi)型、浸潤(rùn)深度、分化程度、食管癌部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、TNM分期等病理信息。<

7、br>　　2.1.2研究方法
　　1）資料收集
　　首先，對(duì)所有參與工作的調(diào)查員進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)，做到標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，采用問(wèn)卷調(diào)查的方式獲取患者信息，內(nèi)容主要包括患者的一般情況（姓名、性別、年齡、職業(yè)、學(xué)歷、民族、家庭詳細(xì)地址、患者或親屬聯(lián)系手機(jī)或電話(huà)號(hào)碼等），行為生活方式（吸煙史、飲酒史等），臨床特征（腫瘤家族史、患癌知情、就診日期和治療醫(yī)院等）等；其次，采用醫(yī)院病案和病理核查的方式收集患者臨床信息和病理資料，內(nèi)容包括過(guò)敏史、HP感

8、染、組織學(xué)類(lèi)型、大體類(lèi)型、食管癌腫瘤部位、腫瘤長(zhǎng)寬厚、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分級(jí)、TNM分期、治療方式和手術(shù)吻合方式等；最后，通過(guò)電話(huà)和家訪(fǎng)等方式對(duì)患者進(jìn)行生存期隨訪(fǎng)，獲得預(yù)后信息。對(duì)收集到的所有資料進(jìn)行科學(xué)整理，反復(fù)核對(duì)，逐步更新。
　　2）生存分析
　　采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件；采用Kaplan-Meier法分析單因素（性別、年齡、腫瘤家族史、大體類(lèi)型、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）對(duì)患者生存期的影響，計(jì)

9、算Log rank P值；多因素分析則采用Cox回歸模型，將單因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目納入，綜合判斷影響預(yù)后的因素，計(jì)算P值、HR值和95% CI；檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。
　　2.2 MHC區(qū)域食管癌GWAS研究
　　2.2.1研究對(duì)象
　　研究對(duì)象來(lái)自本課題組食管癌GWAS的樣品，采用病例-對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。在GWAS初篩階段，使用Illumina610芯片對(duì)1077例食管癌患者和1733例對(duì)照進(jìn)行基因分型，使用Ill

10、umina660芯片對(duì)451例食管癌患者和374例對(duì)照進(jìn)行基因分型。
　　GWAS初篩共計(jì)3635例，其中病例組1528例(男921例，女607例，平均年齡
　　61±19歲)；對(duì)照組2107例(男1052例，女1055例，平均年齡31±15歲)。在驗(yàn)證階段采用TaqMan技術(shù)在另外獨(dú)立的2026例患者和2384例對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證。TaqMan驗(yàn)證共計(jì)4410例，其中病例組2026例(男1256例，女770例，平均年齡60±9歲

11、)；對(duì)照組2384例(男1198例，女1186例，平均年齡50±11歲)。病例組均經(jīng)組織病理學(xué)確診為食管鱗癌，對(duì)照組均經(jīng)上消化道內(nèi)鏡檢查顯示無(wú)早期食管癌和其它上消化道腫瘤。
　　2.2.2研究方法
　　1）GWAS初篩
　　采用主成分分析（principal component analysis，PCA）的方法，排除遺傳學(xué)上偏倚度較大的人群。使用Illumina610和660芯片對(duì)匹配的食管癌和對(duì)照組人群DNA進(jìn)行全基

12、因組SNP掃描分析。SNP位點(diǎn)排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）在病例和對(duì)照組中樣本得率(call rates)<95%；（2）對(duì)照組中最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)<1%；（3）對(duì)照組中哈迪·溫伯格平衡律檢驗(yàn)(Hardy-Weinberg equilibrium test，HWE) P<10-7。按此標(biāo)準(zhǔn)排除不合格SNP后，初步篩選出在MHC區(qū)域有可能與食管鱗癌高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的SNP。
　　2）TaqMan驗(yàn)

13、證
　　對(duì)初篩中篩選出的SNP位點(diǎn)進(jìn)行再次篩選，TaqMan驗(yàn)證選取SNP位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)：（1）在病例和對(duì)照組中MAF>0.05；（2）對(duì)照組中HWE P≥0.001；（3）病例和對(duì)照組中GWAS分析（Cochran-Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)） P<10-4。采用此標(biāo)準(zhǔn)最后鎖定和食管鱗癌高風(fēng)險(xiǎn)可能有關(guān)的SNP位點(diǎn)。采用TaqMan熒光定量基因分型技術(shù)，將篩選出的MHC區(qū)域SNP位點(diǎn)在另外獨(dú)立的食管鱗癌和正常對(duì)照進(jìn)行大樣本量的驗(yàn)證。

14、r>　　3）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)算在MHC區(qū)域檢出SNP的樣本得率、MAF和HWE。對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)用Plink1.03軟件進(jìn)行分析；采用Cochran-Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)，計(jì)算P值、OR值和95%CI，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α=0.05。
　　3、結(jié)果：
　　3.1食管癌大樣本量生存分析結(jié)果
　　3.1.1一般情況對(duì)食管癌生存期的影響
　　女性患者（22723例）生存期長(zhǎng)于男性（38289例）（Logrank P=

15、0.000）；診斷年齡對(duì)食管癌患者預(yù)后有明顯影響，隨著診斷年齡的增大，患者生存期逐步縮短（Log rank P=0.000）；民族對(duì)食管癌患者生存期沒(méi)有影響（Log rank P=0.268）；學(xué)歷對(duì)食管癌患者生存期有明顯影響（Log rank P=0.000）；職業(yè)對(duì)食管癌患者生存期有重要影響（Log rank P=0.000）。
　　3.1.2行為生活方式對(duì)食管癌患者生存期的影響
　　吸煙史對(duì)食管癌患者生存期有顯著影響，

16、有吸煙史者生存期較無(wú)吸煙史者明顯縮短（Log rank P=0.000）；飲酒史對(duì)食管癌患者生存期影響顯著，有飲酒史者生存期較無(wú)飲酒史者顯著縮短（Log rank P=0.000）。
　　3.1.3高低發(fā)區(qū)對(duì)食管癌患者生存期的影響
　　高低發(fā)區(qū)對(duì)食管癌患者生存期影響明顯，高發(fā)區(qū)患者生存期明顯長(zhǎng)于中發(fā)區(qū)和低發(fā)區(qū)患者（Log rank P=0.000）。
　　3.1.4臨床特征對(duì)食管癌患者生存期的影響
　　腫瘤家族史

17、陽(yáng)性患者的生存期顯著長(zhǎng)于家族史陰性患者（Logrank P=0.000）；血型對(duì)食管癌患者生存期無(wú)明顯影響（Logrank P=0.996）；過(guò)敏史對(duì)食管癌患者生存期無(wú)明顯影響（Log rank P=0.148）；單雙眼皮對(duì)食管癌患者生存期有顯著影響（Log rank P=0.003）；HP感染對(duì)食管癌患者生存期無(wú)明顯影響（Log rank P=0.328）；食管癌患者HBV感染陽(yáng)性和陰性間生存期無(wú)差異（Log rank P=0.102

18、）；而HCV陽(yáng)性患者生存期顯著長(zhǎng)于陰性者（Log rank P=0.001）；HIV陽(yáng)性患者生存期明顯長(zhǎng)于陰性者（Log rank P=0.003）。
　　3.1.5病理因素對(duì)食管癌患者生存期的影響
　　食管鱗癌和癌肉瘤患者生存期長(zhǎng)于食管腺癌，食管小細(xì)胞癌生存期最短（Log rank P=0.000）；不同腫瘤部位患者在總體生存期上差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中下段食管癌患者生存期長(zhǎng)于上段癌，頸段癌患者生存期最短（Log rank

19、 P=0.000）；腫瘤長(zhǎng)徑對(duì)食管癌患者生存期有顯著影響，隨著腫瘤長(zhǎng)徑的不斷增長(zhǎng)，患者生存期逐步縮短（Log rank P=0.000）；食管癌腫瘤寬度也對(duì)患者生存期有明顯影響，隨著腫瘤寬度的不斷增長(zhǎng)，患者生存期逐步縮短（Log rank P=0.000）；腫瘤厚度也對(duì)食管癌患者生存期有顯著影響，隨著腫瘤厚度的不斷增長(zhǎng)，患者生存期逐步縮短（Log rank P=0.000）；不同大體類(lèi)型患者在總體生存期上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Logrank

20、 P=0.000）；不同分化程度的食管癌患者生存期差異有顯著性意義，分化程度越差，生存期越短（Logrank P=0.000）；浸潤(rùn)程度是食管癌患者生存期的重要影響因素，隨著 T分期的逐步加深，患者生存期逐步縮短（Log rank P=0.000）；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者生存期顯著長(zhǎng)于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（Log rank P=0.000）；隨著淋巴結(jié)陽(yáng)性轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)的增多，患者生存期逐步縮短（Log rank P=0.000）；淋巴結(jié)切除

21、總數(shù)也對(duì)食管癌患者生存期有顯著影響（Log rank P=0.000）；隨著病理分級(jí)的逐步上升，患者生存期逐步縮短（Log rank P=0.000）；早期癌患者生存期顯著長(zhǎng)于食管癌中期患者，晚期患者生存期最短（Logrank P=0.000）。
　　3.1.6治療因素對(duì)食管癌患者生存期的影響
　　治療方式對(duì)食管癌患者生存期有顯著影響（Log rank P=0.000）；手術(shù)吻合方式對(duì)食管癌患者生存期有顯著影響，頸部吻合術(shù)生

22、存期長(zhǎng)于弓上吻合，弓下吻合生存期最短（Logrank P=0.000）；不同手術(shù)開(kāi)胸方式患者生存期無(wú)差異（Log rank P=0.655）；患食管癌知情者的生存期顯著長(zhǎng)于患癌不知情者（Log rank P=0.000）；不同治療年代的食管癌患者間的生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Logrank P=0.000）。
　　3.1.7 Cox回歸結(jié)果
　　女性是影響食管癌預(yù)后的保護(hù)因素（p=0.000，HR=0.834,95% CI=0

23、.799-0.870）；診斷年齡是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素，≥70歲患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)較<40歲患者明顯增加（P=0.000，HR=1.856，95%CI=1.487-2.317）；腫瘤部位是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素，下段癌患者較頸段癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯減低（P=0.006，HR=0.609，95%CI=0.426-0.869）；分化程度是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素，未分化癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)較高分化癌患者明顯增加（P=0.002，HR

24、=1.503，95%CI=1.155-1.957）；浸潤(rùn)程度是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素（P=0.000，HR=1.372，95%CI=1.323-1.423）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌患者的預(yù)后危險(xiǎn)因素，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者較有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（P=0.000，HR=0.679，95%CI=0.626-0.737）；病理分級(jí)是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素，IV級(jí)食管癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)較0級(jí)患者明顯增加（P=0.007，HR=3.16

25、9，95%CI=1.361-7.378）；治療年代是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素，近五年（2009-2013年）治療的食管癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)較早十年（1974-1983年）治療的患者明顯增加（P=0.000，HR=4.145，95%CI=2.911-5.902）。
　　3.2 MHC區(qū)域食管癌GWAS研究結(jié)果
　　3.2.1食管癌GWAS初篩的MHC區(qū)域結(jié)果
　　通過(guò)對(duì)1528例病例和2107例對(duì)照的PCA后，去除偏離的樣

26、品，得到遺傳學(xué)上匹配的1528例病例和1056例對(duì)照的人群。對(duì)匹配的人群DNA進(jìn)行全基因組SNP掃描，在MHC區(qū)域共檢測(cè)出6252個(gè)SNP位點(diǎn)。通過(guò)質(zhì)量控制有2533個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)入下一步的分析。
　　3.2.2 TaqMan驗(yàn)證結(jié)果
　　經(jīng)過(guò)驗(yàn)證選取 SNP位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，去除不合格的SNP位點(diǎn)后，在 MHC區(qū)域鎖定5個(gè)可能與食管鱗癌高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的SNP位點(diǎn)，分別是：rs17533090(PGWAS=1E-05)，rs35399

27、661(PGWAS=6E-06)，rs1536501(PGWAS=9E-04)，rs911178(PGWAS=6E-04)和rs6901869(PGWAS=3E-05)。在對(duì)2026例病例和2384例對(duì)照的TaqMan驗(yàn)證后，驗(yàn)證出1個(gè)有意義的SNP位點(diǎn)：rs911178(Preplication=1.41E-22)，定位于6p22.1，在SCAN domain containing3(SCAND3)上游35-kb的位置。
　　4

28、、結(jié)論：
　　4.1性別、診斷年齡、食管癌部位、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)和治療年代是食管癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素；吸煙史、飲酒史、高低發(fā)區(qū)、腫瘤家族史、組織學(xué)類(lèi)型、腫瘤長(zhǎng)徑、寬度、厚度、大體類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性個(gè)數(shù)、臨床分期、治療方式、手術(shù)吻合方式和食管癌患者生存期相關(guān)；生存分析對(duì)食管癌臨床防治提供有力依據(jù)。
　　4.2 MHC區(qū)域rs911178（SCAND3基因）和食管鱗癌高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)；本研究加深了