胡蘿卜軟腐果膠桿菌中腐胺HPLC檢測(cè)方法建立及其多胺代謝相關(guān)基因功能研究.pdf

1、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacterterium carotovorum subsp.carotovorum，以下簡(jiǎn)稱Pcc）寄主廣泛，是引起多種經(jīng)濟(jì)作物及觀賞性植物的細(xì)菌性軟腐病的重要病原菌。目前尚缺少有效的防控方法，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，近年來從分子生物學(xué)上對(duì)Pcc致病性的相關(guān)研究逐漸深入，以期為提出理想的防治方法提供依據(jù)。
　　多胺廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是正常細(xì)胞生長(zhǎng)必需的一類以碳為骨架的天然脂

2、肪族胺類物質(zhì)。在生物體內(nèi)的條件下，多胺以聚陽離子形態(tài)存在，且?guī)д姾?，能與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子帶負(fù)電荷互作并影響生物體的各種生理功能，如DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯、核酸的穩(wěn)定性、細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖、膜的穩(wěn)定性等。微生物中多胺特異轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是亞精胺/腐胺ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，包括potABCD系統(tǒng)和potFGHI系統(tǒng)。
　　高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）具有分離效能高

3、、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，在物質(zhì)分離、分析、純化等研究領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛。用HPLC分析多胺的方法的運(yùn)用越來越普遍，尤其是在動(dòng)物、植物、環(huán)境、食物等的多胺含量。然而，在微生物尤其是細(xì)菌中用HPLC分析多胺的方法所報(bào)道文獻(xiàn)并不多見。本研究通過從樣品制備、流動(dòng)相與流動(dòng)相的選擇與比例調(diào)整、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇、流速和柱溫的調(diào)整等方面優(yōu)化，建立了Pcc中腐胺HPLC檢測(cè)方法。為Pcc中參與多胺轉(zhuǎn)運(yùn)、合成相關(guān)基因的功能分析、研究提供支持

4、。結(jié)果表明:以Agilent C18為分離柱（150mm×4.6mm，5μm），柱溫30℃;苯甲酰氯為衍生化試劑，添加量為100μL（樣品量為1mL）;甲醇與水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，建立腐胺HPLC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Pcc中腐胺檢測(cè)。
　　為了闡明相應(yīng)多胺代謝編碼基因的功能，本研究利用同源重組方法得到三株突變體ΔpotA、ΔpotD、ΔspeE，并進(jìn)行致病性、相關(guān)水解酶類、生長(zhǎng)曲線等表型測(cè)定。結(jié)果表明:與Pcc

5、S1相比，ΔpotA、ΔpotD、ΔspeE三株突變體的致病能力、產(chǎn)生蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、碳青霉烯抗生素等方面的能力、生長(zhǎng)速率等表型均沒有變化。表明PccS1中幾個(gè)與多胺代謝相關(guān)基因potA(PC1-2235)、potD(PC1-1859)、speE（PC1-3129）對(duì)致病性不具關(guān)鍵作用。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期得到腐胺代謝相關(guān)基因缺失突變體ΔpotF、ΔpotG、ΔpotH、ΔpotI，其中ΔpotG致病能力顯著下降。本研究利