復(fù)方柴歸方抗抑郁有效組分篩選及其藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究.pdf

1、選題依據(jù):抑郁癥是常見的情感性或心理性疾病。研究顯示:目前，中國(guó)大約有抑郁癥患者3000萬人，全球范圍內(nèi)有超過5億人正遭受著抑郁癥的折磨，其終身患病率高達(dá)20％。然而，目前治療抑郁癥的藥物不甚理想，主要以化學(xué)藥物為主，如單胺氧化酶抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等，但這些藥物都存在治療譜窄、不良反應(yīng)大、耐受性差以及價(jià)格昂貴等問題[1～3]，而近年國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥（特別是復(fù)方）治療抑郁癥在改善癥狀、降低復(fù)發(fā)率、減少西藥

2、副作用方面具有獨(dú)特效果。本課題依據(jù)臨床報(bào)道逍遙散（丸）在抑郁癥治療上顯示出的獨(dú)特效果，在前期研究基礎(chǔ)上，從逍遙散類方中篩選出逍遙散為最佳抗抑郁復(fù)方，又依逍遙散最佳抗抑郁組分的化學(xué)成分分析和藥效學(xué)篩選，得出復(fù)方柴歸方（紅柴胡、香附、青皮、甘草、生姜、薄荷），對(duì)該方抗抑郁有效組分進(jìn)行系統(tǒng)而完善的工藝篩選、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)及安全性初步評(píng)價(jià)等規(guī)范化研究工作。
　　 目的:基于中醫(yī)整體觀研究思路，從行為學(xué)和1H-NMR代謝組學(xué)兩個(gè)方面驗(yàn)證復(fù)方柴

3、歸方代替逍遙散原方的可行性，并對(duì)其制備工藝、最佳給藥劑量及安全性等方面進(jìn)行初步探究。
　　 方法:在前期從逍遙散類方中篩選出逍遙散為最佳抗抑郁復(fù)方的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其君藥基源進(jìn)行篩選;依據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期篩選出逍遙散石油醚組分為最佳抗抑郁有效組分基礎(chǔ)上，并且采用HPLC-UV法、HPLC-ELSD法、GC-MS法等化學(xué)成分分析方法對(duì)逍遙散全方及單味藥材進(jìn)行化學(xué)成分歸屬分析的研究結(jié)果，對(duì)去掉“白芍”和“茯苓”的“復(fù)方柴歸方”(紅柴胡30

4、 g，香附30 g，青皮30 g，甘草15g，薄荷10 g，生姜10g)石油醚組分采用小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)與逍遙散原方石油醚組分進(jìn)行藥效學(xué)比較;在確定了復(fù)方柴歸方及其最佳比例的基礎(chǔ)上，探索了對(duì)可代替石油醚萃取的制備工藝，擬定了無毒、無污染、高效率的超臨界CO2流體萃取方法得到復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分。采用小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)對(duì)該組分與石油醚組分進(jìn)行抗抑郁藥效活性比較。運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)研究超臨界CO2最佳工藝參數(shù)條件

5、，并從產(chǎn)率以及行為學(xué)兩個(gè)指標(biāo)確定其最佳工藝參數(shù)，同時(shí)對(duì)復(fù)方柴歸方不同藥材組合提取方法得到的超臨界CO2有效組分進(jìn)行抗抑郁活性篩選;在確定了復(fù)方柴歸方及其超臨界CO2最佳萃取工藝條件的基礎(chǔ)上，萃取該方有效組分，采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型(CUMS)從行為學(xué)和1H-NMR代謝組學(xué)兩個(gè)方面對(duì)該方有效組分展開藥效學(xué)評(píng)價(jià);應(yīng)用小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)和大鼠長(zhǎng)期毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)其安全性進(jìn)行初步探究。
　　 結(jié)果:1.不同品種柴胡組成的逍遙散都具

6、有明顯的抗抑郁作用，但功效有所差別，即紅柴胡組成逍遙散的抗抑郁效果及起效時(shí)間略優(yōu)于北柴胡，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.通過實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)逍遙散最佳抗抑郁有效組分篩選以及進(jìn)行化學(xué)成分歸屬分析后發(fā)現(xiàn)逍遙散中的“白芍”和“茯苓”兩味藥材的石油醚組分對(duì)復(fù)方石油醚組分的化學(xué)成分幾乎無貢獻(xiàn)的研究結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)擬去掉“白芍”和“茯苓”這兩味藥形成復(fù)方柴歸方(紅柴胡30 g，香附30 g，青皮30 g，甘草15 g，薄荷10 g，生姜10g)，對(duì)復(fù)

7、方柴歸方石油醚組分采用小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)與逍遙散石油醚組分進(jìn)行藥效學(xué)比較。結(jié)果表明復(fù)方柴歸方石油醚組分與原逍遙散方石油醚組分抗抑郁效果相當(dāng)。
　　 3.復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分與其石油醚組分進(jìn)行藥效學(xué)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超臨界CO2有效組分與石油醚組分對(duì)于小鼠不動(dòng)時(shí)間的減少?zèng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明了超臨界CO2流體萃取工藝代替石油醚萃取工藝的可行性。運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)摸索了超臨界CO2萃取復(fù)方柴歸方有效組分的最佳工藝參數(shù)。

8、并對(duì)最佳提取工藝條件進(jìn)行藥效學(xué)驗(yàn)證，最終研究結(jié)果表明復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分抗抑郁效果明確，最佳工藝參數(shù)為萃取壓力20 MPa，萃取溫度50℃，CO2流量55 kg/h，物料粒度20目，萃取時(shí)間3h，得率為2.2％。同時(shí)對(duì)復(fù)方柴歸方不同藥材組合提取方法得到的超臨界CO2有效組分進(jìn)行抗抑郁活性篩選，結(jié)果表明復(fù)方柴歸全方超臨界CO2提取物抗抑郁效果最佳。
　　 4.采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型(CUMS)從行為學(xué)和1H-

9、NMR代謝組學(xué)兩個(gè)方面對(duì)復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。行為學(xué)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)前各組大鼠的體重、糖水偏愛率及各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在造模第21天時(shí)，空白對(duì)照組和模型組在各項(xiàng)指標(biāo)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)第21天時(shí)造模成功，各給藥組中復(fù)方柴歸中劑量組對(duì)CUMS模型的干預(yù)效果最佳。
　　 尿液NMR代謝組學(xué)結(jié)果分析:采用NOESY核磁序列對(duì)大鼠尿液中的代謝物進(jìn)行分析，結(jié)合單變量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對(duì)代謝物的主成

10、分分析得到的載荷圖中離原點(diǎn)遠(yuǎn)的那些代謝物在空白對(duì)照組和模型組中的峰面積進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)算P值。只有P值小于0.05的代謝物為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組大鼠相比，模型組能引起大鼠尿液中醋酸、丙酮酸、琥珀酸、2-氧化戊二酸、檸檬酸、甘氨酸等含量的變化。復(fù)方柴歸中劑量組能較好地調(diào)節(jié)這些與抑郁相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。
　　 5.初步安全性評(píng)價(jià)結(jié)果表明復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分毒性較低、副作用小、在一定

11、的劑量范圍內(nèi)使用安全。
　　 結(jié)論:1.復(fù)方柴歸方來源于傳統(tǒng)中藥逍遙散，由紅柴胡、香附、青皮、甘草、生姜和薄荷等組成，其中的低極性組分抗抑郁效果確切，對(duì)逍遙散原方具有可代替性。
　　 2.不同抑郁癥動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，采用天然、無毒、無污染的超臨界流體CO2萃取工藝制備而成的復(fù)方柴歸方有效組分的抗抑郁效果確切，且略優(yōu)于其石油醚組分。說明了超臨界CO2萃取工藝的可行性。
　　 3.復(fù)方柴歸方超臨界CO2有效組分