表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：隨著人們生活水平的日益提高，無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家或是發(fā)展中國(guó)家，代謝綜合征發(fā)病率逐漸升高。2型糖尿病、肥胖等，已成為人類健康的重大威脅。此類人群比正常人群更易出現(xiàn)心血管疾病，其原因在于：長(zhǎng)期的、慢性的血脂肪酸水平升高，可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，并可損傷冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致缺血性心肌損傷；值得引起重視的是，高脂肪酸水平也可直接損傷心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，稱為脂毒性心肌損傷。棕櫚酸(palmitate，PA)，一種常見(jiàn)的飽和脂肪酸，被廣泛應(yīng)用于

2、體外細(xì)胞培養(yǎng)，制造脂毒性損傷模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。PA已被證實(shí)可誘導(dǎo)包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種組織細(xì)胞凋亡，而心肌細(xì)胞凋亡是心功能衰竭、再灌注損傷等的重要原因。因此，減輕心肌細(xì)胞凋亡可能是對(duì)抗脂毒性心肌損傷的關(guān)鍵策略。臨床試驗(yàn)證實(shí)，長(zhǎng)期、規(guī)律攝入綠茶可以降低血清膽固醇水平、降低體內(nèi)脂肪含量、抑制脂肪細(xì)胞生成、降低體重，對(duì)于維持體內(nèi)脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。作為綠茶中提取的茶多酚生物活性的主要成份，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigalloca

3、techin-3-gallate，EGCG)被證實(shí)具有極強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用，被廣泛應(yīng)用于心血管領(lǐng)域和腫瘤領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。重要的是，也有研究證實(shí)，無(wú)論是在體動(dòng)物模型還是體外細(xì)胞模型，EGCG對(duì)于脂質(zhì)代謝均可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，于飲食中加入一定劑量EGCG可降低血清膽固醇含量和身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EGCG可直接減輕PA導(dǎo)致的脂毒性內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。以上證據(jù)提示，EGC

4、G具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和保護(hù)脂毒性損傷的雙重作用。然而，針對(duì)EGCG對(duì)于心肌細(xì)胞的脂毒性損傷是否具有保護(hù)作用，目前尚未明確。本研究擬通過(guò)高脂培養(yǎng)基進(jìn)行H9C2心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)，建立心肌細(xì)胞脂毒性損傷模型，通過(guò)ERS抑制劑4-PBA研究ERS相關(guān)的凋亡在高脂損傷中的作用，研究脂毒性心肌損傷的分子機(jī)制;探討EGCG預(yù)處理對(duì)于心肌細(xì)胞高脂損傷的保護(hù)作用，并通過(guò)信號(hào)通路抑制劑進(jìn)一步研究EGCG對(duì)抗脂毒性心肌損傷的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：⑴將

5、H9C2心肌細(xì)胞分為4組，對(duì)照組培養(yǎng)基中含有0.1％BSA，模型組分別以不同濃度(100μM、200μM、400μM) PA培養(yǎng)12小時(shí)，油紅O染色法鑒定高脂模型建立。⑵采用不同濃度的PA(0-500μM)處理細(xì)胞不同的時(shí)間（0小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)），通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，并根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)中合適的PA處理?xiàng)l件。⑶將H9C2心肌細(xì)胞分為4組，對(duì)照組培養(yǎng)基中含有0.1％BSA，模型組分別以不同濃度（100μM

6、、200μM、400μM）PA培養(yǎng)12小時(shí)，誘導(dǎo)脂毒性損傷。分別用可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，western blot技術(shù)檢測(cè)不同濃度PA對(duì)心肌細(xì)胞中GRP78，CHOP， Cleaved caspase-12，PERK/eIF2α通路分子表達(dá)的影響。⑷將H9C2心肌細(xì)胞分為5組:分別以PA400μM培養(yǎng)不同時(shí)間（0小時(shí)，3小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)），以western blot技術(shù)檢

7、測(cè)PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α，ATF4，CHOP，Cleaved caspase-12的表達(dá)情況，探討PERK通路分子和ERS相關(guān)凋亡蛋白在PA誘導(dǎo)脂毒性損傷過(guò)程中的變化規(guī)律。⑸將H9C2心肌細(xì)胞分為3組：對(duì)照組培養(yǎng)基中含有0.1％BSA，培養(yǎng)12小時(shí)；PA模型組以PA400μM培養(yǎng)12小時(shí)；4-PBA組:先以5mM的4-PBA預(yù)處理90分鐘，再加入PA400μM共同培養(yǎng)12小時(shí)。以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4-PBA對(duì)PA

8、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的影響，以western blot技術(shù)檢測(cè)4-PBA對(duì)PA培養(yǎng)下ERS相關(guān)凋亡蛋白CHOP、Cleaved caspase-12的影響。⑹以不同濃度（1.0μM，5.0μM，10μM，25μM，50μM）的EGCG預(yù)處理細(xì)胞后加入PA400μM共同培養(yǎng)12小時(shí)，以CCK-8法檢測(cè)EGCG對(duì)于PA培養(yǎng)下細(xì)胞活力的影響，根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)中合適的EGCG處理?xiàng)l件。⑺選擇具有最佳保護(hù)作用的2個(gè)濃度EGCG5μM和10μM作

9、為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中LDH含量、DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡、western blot技術(shù)檢測(cè)p-Akt與Akt表達(dá)。進(jìn)一步觀察EGCG的保護(hù)作用及對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用。⑻在EGCG實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，加入PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002，以western blot技術(shù)檢測(cè)Cleavedcaspase-3，CHOP，Cleaved caspase-12，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α蛋白

10、表達(dá)，探討EGCG對(duì)抗脂毒性損傷作用的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：①PA培養(yǎng)12小時(shí)即可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞活力下降，從PA200μM至500μM心肌細(xì)胞活力逐漸下降，呈PA劑量依賴性。選擇PA100μM，200μM，400μM進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PA200μM以上濃度處理12小時(shí)可引起LDH釋放增加。②流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示PA200μM以上濃度可引起細(xì)胞凋亡率增加;western blot結(jié)果提示PA可上調(diào)ERS標(biāo)志性分子GRP78、ERS凋

11、亡蛋白CHOP和Cleaved caspase-12、PERK通路蛋白的表達(dá)，且上述改變均呈現(xiàn)明顯的正性PA劑量依賴性。③以PA400μM處理細(xì)胞3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，western blot技術(shù)結(jié)果提示，PERK分子在PA處理后的3小時(shí)顯著激活，表現(xiàn)為磷酸化水平的提高;作為p-PERK的特異性底物，p-eIF2α在3小時(shí)顯著激活，6小時(shí)達(dá)峰值;下游的ATF4在PA處理的6小時(shí)顯著激活，此后表達(dá)量逐漸升高，24小時(shí)達(dá)峰值。

12、作為ERS相關(guān)凋亡的特異性分子，CHOP和Cleaved caspase-12在PA處理的12小時(shí)表達(dá)量顯著提高，并持續(xù)至PA處理后的24小時(shí)。④流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，以ERS特異性抑制劑4-PBA5mM預(yù)處理90分鐘，顯著降低PA導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，western blot結(jié)果提示4-PBA可顯著下調(diào)ERS相關(guān)凋亡特異性蛋白CHOP和Cleaved caspase-12的表達(dá)，說(shuō)明ERS相關(guān)的凋亡作為重要機(jī)制參與PA導(dǎo)致的心肌細(xì)胞脂毒性

13、損傷。⑤以EGCG預(yù)處理細(xì)胞，CCK-8結(jié)果顯示EGCG5μM和10μM對(duì)于PA400μM導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有最佳保護(hù)作用，該結(jié)果被進(jìn)一步的LDH含量和DAPI染色結(jié)果所證實(shí)。PA處理可顯著降低心肌細(xì)胞的Akt分子磷酸化水平，EGCG5μM和10μM可部分恢復(fù)Akt分子的磷酸化水平的降低，發(fā)揮上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路活性，對(duì)抗脂毒性損傷的作用。⑥EGCG10μM預(yù)處理前加入LY294002預(yù)處理1小時(shí)，可部分抵消EGCG10μM對(duì)于脂毒

14、性損傷的保護(hù)作用，體現(xiàn)為:EGCG降低凋亡率、下調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)、下調(diào)ERS特異性凋亡蛋白CHOP和Cleaved caspase-12的表達(dá)、抑制PERK/eIF2α通路過(guò)度活化的作用均被LY294002部分抵消。
　　結(jié)論：⑴PA可呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性的方式激活H9C2心肌細(xì)胞ERS、PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)通路，繼而激活ERS相關(guān)的凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。ERS抑制劑4-PB

15、A可顯著減輕PA導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。⑵EGCG可提高PA培養(yǎng)下的H9C2心肌細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表達(dá)，降低LDH釋放，對(duì)抗脂毒性損傷。⑶EGCG可上調(diào)PA培養(yǎng)下的H9C2心肌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路活性，進(jìn)而抑制ERS、PERK/eIF2α信號(hào)通路的過(guò)度激活，下調(diào)ERS相關(guān)凋亡蛋白CHOP、Cleaved caspase-12的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY2