乳腺癌細胞中CD74乙?；{(diào)控的分子機制.pdf

1、研究背景
　　癌癥又稱惡性腫瘤，是人類主要的致死疾病之一。作為女性中發(fā)病率最高的一類癌癥，乳腺癌使女性的健康受到了嚴重的威脅。而該疾病最主要的致死因素就是癌細胞的轉(zhuǎn)移擴散引起的多器官病變。因此，乳腺癌轉(zhuǎn)移機制的研究對其治療有著非常重要的意義。
　　CD74在人類中共有四種亞型:p33，p41，p35，p43，我們在乳腺癌中主要檢測到的是p35這一亞型。CD74可以發(fā)生多種翻譯后修飾，如N/O糖基化，磷酸化，棕櫚?；?而CD7

2、4乙?；@一修飾還未見報道。CD74最初被發(fā)現(xiàn)是作為MHCⅡ的分子伴侶，在抗原遞呈中起重要作用。隨后發(fā)現(xiàn)CD74也具有不依賴MHCⅡ的功能，如作為細胞表面受體，即巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)的受體，引起信號級聯(lián)反應(yīng);調(diào)控樹突狀細胞遷移等。我們的前期數(shù)據(jù)表明，CD74調(diào)控乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移，而乳腺癌細胞中CD74表達調(diào)控的分子機制并不清楚。
　　YB1(Y-Box binding protein1)在結(jié)構(gòu)上分為多變非保守的N端結(jié)構(gòu)域，

3、高度保守的冷休克結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域三部分。N端結(jié)構(gòu)域含有豐富的丙氨酸和脯氨酸，與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān);C端結(jié)構(gòu)域由酸性殘基和堿性殘基交替組成，與調(diào)節(jié)蛋白與蛋白之間的相互作用有關(guān)。YB1最初被發(fā)現(xiàn)是作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到MHCⅡ的啟動子區(qū)。YB1在DNA、mRNA和蛋白質(zhì)多種水平上發(fā)揮作用，如參與DNA的修復(fù)、前體mRNA的剪切、維持mRNA的穩(wěn)定性以及蛋白與蛋白之間的相互作用等。前期工作中，我們利用軟件分析，發(fā)現(xiàn)在CD74的啟動子區(qū)以及CD74的m

4、RNA上都可能存在YB1的調(diào)控位點。因此，我們將重點研究YB1是如何調(diào)控CD74從而影響細胞轉(zhuǎn)移的，以期尋找到新的化療靶標。
　　研究方法
　　1.免疫印跡檢測YB1 siRNA干擾實驗對CD74及細胞運動相關(guān)蛋白表達的影響
　　2.RT-PCR實驗檢測YB1 siRNA干擾實驗在CD74轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　3.免疫印跡檢測YB1 siRNA干擾實驗對CD74蛋白穩(wěn)定性的影響以及免疫共沉淀實驗探究YB1 siRN

5、A干擾實驗對CD74泛素化的影響
　　4.免疫共沉淀實驗探究CD74的乙?；揎椧约百|(zhì)譜檢測CD74可能發(fā)生乙?；陌被嵛稽c
　　5.免疫共沉淀實驗探究YB1對CD74乙酰化的影響
　　6.免疫共沉淀實驗探究YB1和CD74以及其他相關(guān)蛋白之間的相互作用
　　7.免疫共沉淀實驗探究SIRT1對CD74乙?；挠绊?br>　　8.免疫共沉淀實驗探究三位點突變的CD74與YB1、SIRT1、CD44之間結(jié)合能力的改

6、變
　　9.Transwell實驗檢測CD74乙酰化對細胞侵襲的影響
　　10.免疫共沉淀實驗探究CD74乙?；cCD74泛素化之間的關(guān)系
　　實驗結(jié)果
　　1.敲低YB1下調(diào)CD74和細胞運動相關(guān)蛋白的表達
　　2.YB1調(diào)控CD74的穩(wěn)定性是在蛋白水平上而非轉(zhuǎn)錄水平
　　3.CD74存在乙酰化修飾，并且YB1影響CD74的乙酰化
　　4.CD74與YB1、SIRT1和HDAC1蛋白之間存在相

7、互作用
　　5.SIRT1影響CD74的乙酰化水平
　　6.質(zhì)譜分析CD74潛在的乙?；稽c分別是Lys80、Lys99和Lys106，將賴氨酸突變?yōu)榫彼岷驝D74的乙酰化水平減弱，泛素化水平降低
　　7.CD74乙?；稽c突變影響CD74與YB1、SIRT1、CD44之間的結(jié)合
　　8.CD74乙?；稽c突變影響細胞侵襲
　　實驗結(jié)論
　　在人乳腺癌細胞中，我們發(fā)現(xiàn)YB1通過影響CD74與去乙酰化