基于NK3R的抗腫瘤血管生成肽的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　血管生成是新生血管形成的基礎(chǔ)，近年來(lái)，有大量的研究表明，血管生成在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。因此，抗腫瘤血管生成研究是抗腫瘤治療領(lǐng)域中極有前景的一個(gè)重要方向。但是近年來(lái)，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的血管生成抑制劑，特別是針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的單抗類(lèi)藥物，在臨床前或臨床水平上表現(xiàn)出嚴(yán)重毒副作用。因此，尋找新靶點(diǎn)或新藥物分子對(duì)于抗腫瘤血管生成新策略的開(kāi)發(fā)具有重要的意義。既往研究發(fā)現(xiàn)速激肽

2、受體家族的重要成員之一，神經(jīng)激肽-3受體（NK3R），在機(jī)體內(nèi)多種生理過(guò)程中起到重要作用，但對(duì)其在血管生成中的作用和機(jī)制仍然不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)，NK3R的高親和配體，內(nèi)源性神經(jīng)激肽B（NKB）可抑制血管生成，這表明靶向抑制 NK3R通路可有效阻斷新生血管生成?；谝陨涎芯浚菊撐幕?NK3R激動(dòng)劑[MePhe7]NKB，通過(guò)引入腫瘤靶向序列 NGR和CNGRC，分別構(gòu)建了兩種類(lèi)似物 NK3R-A1與 NK3R-A2。通過(guò)一系列體內(nèi)外

3、實(shí)驗(yàn)探索NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物的抗血管生成作用和抗腫瘤效應(yīng)，通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]研究NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物的作用機(jī)制。
　　研究目的：
　　本研究的主要目的是對(duì)本論文設(shè)計(jì)的兩種基于NK3R激動(dòng)劑[MePhe7]NKB結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造的NK3R激動(dòng)劑類(lèi)似物NK3R-A1和NK3R-A2在體內(nèi)和體外分別進(jìn)行抗血管生成作用及其機(jī)制的研究。
　　研究方法：
　　基于本實(shí)驗(yàn)室前期工

4、作基礎(chǔ)，通過(guò)大量文獻(xiàn)查閱，本論文從NK3R激動(dòng)劑[MePhe7]NKB出發(fā)，通過(guò)引入兩類(lèi)腫瘤靶向序列，構(gòu)建了結(jié)構(gòu)改造的NK3R激動(dòng)劑類(lèi)似物NK3R-A1和NK3R-A2。通過(guò)Fmoc固相合成策略合成了NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物以及NK3R拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]，以反相高效液相色譜法進(jìn)行純化，經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)結(jié)構(gòu)正確。然后通過(guò)明膠海綿-雞胚尿囊膜（ gelatin sponge-CAM）實(shí)驗(yàn)對(duì)上述三種 NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物進(jìn)行抗

5、血管生成作用的研究，并運(yùn)用拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]進(jìn)行相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證它們的作用機(jī)制；其次通過(guò)體外的 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及兩種經(jīng)典的遷移實(shí)驗(yàn)，對(duì)這三種 NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物進(jìn)行體外的抗血管生成研究，同時(shí)利用[Gly6]NKB[3-10]進(jìn)行相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)探討其作用機(jī)制；另外，本研究還進(jìn)行了體內(nèi)小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃兔庖呓M織化學(xué)（IHC）染色實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)過(guò)藥物處理的腫瘤組織進(jìn)行結(jié)果分析。并最終對(duì)待測(cè)多肽類(lèi)藥物的抑瘤效

6、果和抗腫瘤血管生成作用進(jìn)行評(píng)估。
　　研究結(jié)果：
　　以Fmoc固相多肽合成方法合成了NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物[MePhe7]NKB（ Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2）、 NK3R-A1（ Asn-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2）、 NK3R-A2（ Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-

7、Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2）以及NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]（His-Asp-Phe-Gly-Val-Gly-Leu-Met-NH2），以反相高效液相色譜儀純化，質(zhì)譜鑒定證明分子量正確。進(jìn)一步的 gelatin sponge-CAM實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述三種NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物都體現(xiàn)出了抗血管生成作用。用NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]預(yù)處理后，三種

8、多肽的抗血管生成作用均被抑制。
　　隨后進(jìn)入體外研究，MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種被檢測(cè)多肽在24小時(shí)內(nèi)對(duì)HUVECs的增殖沒(méi)有明顯的影響，但藥物作用大于24小時(shí)后，出現(xiàn)了一定的細(xì)胞殺傷作用，因此在后續(xù)的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中藥物處理時(shí)間限時(shí)在24小時(shí)之內(nèi)。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，50μM的[MePhe7]NKB、25μM的NK3R-A1和NK3R-A2在藥物作用24小時(shí)時(shí)體現(xiàn)了最好的抑制HUVECs遷移的效果。抑制率分別達(dá)到了20.0％、

9、73.2%以及53.7%；Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中也得到了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陰性對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)目分別是5μM的[MePhe7]NKB、NK3R-A1與NK3R-A2的2.3倍、5.0倍和7.0倍，三種多肽都體現(xiàn)出了在體外很好的抑制HUVECs遷移的效果，證明了它們?cè)隗w外的抗血管生成作用。值得注意的是，NK3R-A1與NK3R-A2在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中相較于[MePhe7]NKB，具有更好的抗血管生成作用。聯(lián)合應(yīng)用拮抗劑[Gly6]

10、NKB[3-10]對(duì)HUVECs進(jìn)行預(yù)處理后，三種多肽的抗血管生成作用被明顯抑制，證明其抗血管生成作用是通過(guò)NK3R通路介導(dǎo)的。細(xì)胞劃痕競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，NK3R-A1與NK3R-A2拮抗組的“愈合程度”分別達(dá)到了96.3%和97.6%，[MePhe7]NKB拮抗組的“愈合程度”幾乎達(dá)到和陰性對(duì)照組相同的水平，說(shuō)明三種檢測(cè)多肽的抗血管生成作用幾乎被完全拮抗；Transwell細(xì)胞遷移競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，拮抗組的遷移細(xì)胞數(shù)目分別是[M

11、ePhe7]NKB、NK3R-A1與 NK3R-A2單獨(dú)處理組的3.9倍、2.8倍和3.3倍，依舊在一定程度上拮抗了NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物的抗血管生成作用。
　　而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和生理鹽水組相比，經(jīng)過(guò)三種NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物高低劑量組處理后，瘤組織體積在給藥期間顯著減小，較陰性對(duì)照組瘤體積減小50%左右。第15天，小鼠脫頸處死，取出瘤組織進(jìn)行稱(chēng)重，發(fā)現(xiàn)所有的藥物處理組的瘤重均明顯小于生理鹽水組，其中以[MePhe7]NK

12、B的高劑量組和NK3R-A1的低劑量組表現(xiàn)出了更好的抑制效果，抑瘤率均達(dá)到了~60%。而IHC染色的結(jié)果也顯示出，藥物處理組的微血管密度（MVD）相比于陰性對(duì)照組有著明顯的減少。值得注意的是，NK3R-A1與NK3R-A2藥物處理組的MVD值相較于[MePhe7]NKB有所減少，說(shuō)明了前兩者具有一定的抗腫瘤血管生成作用。
　　研究結(jié)論：
　　綜上所述，本論文通過(guò)對(duì)NK3R激動(dòng)劑及其類(lèi)似物[MePhe7]NKB、NK3R-A1