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文檔簡介
1、腺病毒(Adenovirus,Ad)是臨床基因治療中最常見的病毒載體之一,大概占到其中的四分之一。腺病毒載體與其他病毒載體相比,復(fù)制能力不高,具有低免疫原、低毒反應(yīng)、自身基因不整合到宿主基因組等優(yōu)點(diǎn);與非病毒載體相比,腺病毒也有高效的轉(zhuǎn)染率。隨著近幾年納米材料技術(shù)的快速發(fā)展,腺病毒載體作為一種新型的納米材料,不僅僅可以攜帶外源目的基因,還可以成為藥物小分子和抗原、多肽等大分子的載體,從而實(shí)現(xiàn)活體成像,藥物靶向以及緩慢釋放等功能。而喜樹堿
2、類藥物是臨床上治療腫瘤的有效藥物之一,但大部分該類藥物因自身復(fù)雜的大共軛結(jié)構(gòu)使得其溶解性不好,并且缺乏組織靶向性,對機(jī)體也有較大的副作用。作者通過在10-羥基喜樹堿(10-Hydroxycamptothecin,HCPT)的10位、20位羥基引入丁二酸基團(tuán)來改善HCPT的水溶性,提高內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性;并以丁二酸為鏈接,與腺病毒衣殼蛋白表面的氨基共價(jià)偶聯(lián),合成一種新型的喜樹堿前體藥物-10羥基喜樹堿.丁二酸一腺病毒,并用結(jié)腸癌細(xì)胞檢測其對細(xì)
3、胞生長的影響。
首先,將丁二酸酐與10-羥基喜樹堿的10位、20位羥基酯化得到喜樹堿衍生物-10,20(S)-O-_琥珀酰羥基喜樹堿(10,20(S)-O-disuccinyl-Hydroxycamptothecin,DSH),所得衍生物經(jīng)核磁共振氫譜進(jìn)行表征;用水浴攪拌法測定DSH在水中的溶解度;采用MTT比色法檢測衍生物對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長抑制:瓊脂糖凝膠電泳測定DNA片段,Hoechst33342染色檢測樣品
4、是否能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明,丁二酸酐的羧基成功與10-羥基喜樹堿的10位、20位羥基酯化;DSH在水中的溶解度(25℃)為2.3mg,溶解度要比10-羥基喜樹堿提高約22倍;腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用呈劑量/時(shí)間依賴性,其半抑制濃度(IC50值)為700nM,效果不如10-羥基喜樹堿,推測可能是由于20位的丁二酸基團(tuán)干擾喜樹堿內(nèi)酯環(huán)與拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用;而瓊脂糖凝膠電泳檢測到典型的DNA梯狀圖譜,Hoechst33342染色表明喜樹堿類衍生
5、物可誘導(dǎo)凋亡。
其次,通過293A細(xì)胞大量擴(kuò)增含有增強(qiáng)熒光蛋白基因的腺病毒Ads-EGFP,用CsC1梯度離心法純化該病毒,TCID50法測得腺病毒的滴度,并且在倒置熒光顯微鏡下觀察腺病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞SW480后熒光蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,腺病毒的滴度為1×1010nfu,純化后的腺病毒Ads-EGFP可以正常的感染腫瘤細(xì)胞,而且感染效率較高。
最后,活化DSH的羧基,與腺病毒4℃反應(yīng)12h,經(jīng)Sephade
6、xG-25純化后獲得產(chǎn)物10-羥基喜樹堿.丁二酸一腺病毒(DSH-Ad);利用連續(xù)波長紫外掃描鑒定復(fù)合物,并用DSH回收率法測定DSH與Ad的共價(jià)結(jié)合分子數(shù);MTT比色法比較DSH-Ad及相應(yīng)濃度的DSH、HCPT、Ad對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長抑制作用;并在倒置熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)各組分對腺病毒在細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)的影響;Hoechst33342染色觀察樣品對結(jié)腸癌細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)情況。結(jié)果表明DSH-Ad在腺病毒和10-羥基喜樹
7、堿的最大吸收峰260nm、375nm處都有吸收峰,初步表明DSH-Ad的合成成功;經(jīng)回收率法測的腺病毒與DSH的共價(jià)分子結(jié)合數(shù)為363±24(n=4);MTT比色法說明DSH-Ad對細(xì)胞有較明顯的生長抑制作用,并且與相對應(yīng)的10-羥基喜樹堿濃度呈相關(guān)性,而相同濃度下的DSH對細(xì)胞的生長并沒有太大影響,推測可能由于DSH-Ad在進(jìn)入細(xì)胞后,DSH中新生成的酯鍵被水解為10-羥基喜樹堿;熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)DSH-Ad會嚴(yán)重影響熒光蛋白的表達(dá),
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