花生球蛋白Ara5基因組DNA克隆及Ara1和Ara3啟動子功能鑒定.pdf

1、利用EST和RACE技術(shù)，克隆到5個油質(zhì)蛋白的全長cDNA序列(Aho1eo 14.3，Aholeo 14.4， Aholeo 16.9，Ahleo 17.8，Aholeo 18.5)。其中Aholeo 14.3和Aholeo 14.4的氨基酸同源性為97％，為同一基因的兩個variants。Southernbolt分析表明，這些油質(zhì)蛋白基因在基因組中拷貝數(shù)為1-2個。氨基酸同源性分析將它們分為兩類，其中Aholeo 17.8和Aho

2、leo 18.5為高分子量油質(zhì)蛋白，Aholeo 14.3、Aholeo 14.4和．Aholeo 16.9屬于低分子量油質(zhì)蛋白。對開放讀碼框進(jìn)行PCR擴(kuò)增證實(shí)它們不存在內(nèi)含子。半定量RT-PCR分析表明4個油質(zhì)蛋白基因只在花生種子各個時(shí)期表達(dá)，在根、莖和葉中無表達(dá)。 花生球蛋白是重要的一種貯藏蛋白，不僅為種子萌發(fā)提供足夠的營養(yǎng)，而且其中一部分屬于花生過敏原。在本實(shí)驗(yàn)室已有研究的基礎(chǔ)上，克隆到花生球蛋白基因Aral和Ara 3的

3、上游啟動子區(qū)域，分別為410bp和657bp。同時(shí)還克隆了Ara 5的基因組DNA序列(3265bp，其中上游啟動子區(qū)域?yàn)?98bp)。Ara 5的基因組DNA序列中含有3個內(nèi)含子，分別為429bp、249bp和99bp。對3個基因的上游序列的順式元件分析結(jié)果表明，這些基因除了含有多個調(diào)控啟動轉(zhuǎn)錄過程的TATA-boxes、CAAT-box外，均含有可能參與種子的特異表達(dá)的元件，如RY-repeated element、legumin

4、box、ACTG-core elements和E-box。將克隆得到的Ara l上游啟動子區(qū)410bp序列和Ara 3的上游643bp序列分別與pBll01.1的GUS基因相連構(gòu)建表達(dá)載體pBAl和pBA3并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥。在pBA3和pBAl的轉(zhuǎn)化植株中檢測GUS活性，結(jié)果表明Ara 1和Ara 3啟動子只驅(qū)動GUS基因在種子中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)9天后檢測不到GUS活性。GUS熒光定量測定表明，Ara 3和Ara 1分別比