人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的微囊通過(guò)miR-30抑制線粒體碎裂減輕急性腎臟缺血再灌注損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human Wharton-Jelly mesenchymal stromal cells,hWJ-MSC）來(lái)源的微囊（extracellular vesicles,EVs）對(duì)大鼠腎急性缺血再灌注損傷的治療作用，并進(jìn)一步探索線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)的機(jī)制研究。
　　方法：
　　從人臍帶內(nèi)分離出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)至3-6代后分別用miR-30b/c/d抑制劑處理24小時(shí)，更換正常培養(yǎng)基后再

2、無(wú)血清處理24小時(shí)，收集其條件培養(yǎng)基（conditional medium），運(yùn)用差速離心法分離提純微囊，并做蛋白定量。8周齡SD大鼠分為假手術(shù)組、損傷組、EV治療組、EVs+miR抑制劑對(duì)照組和EVs+miR-30b/c/d抑制組共8組，并建立單側(cè)腎缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）模型（右腎切除，左腎缺血45分鐘后再灌注）；EV治療組、miR抑制劑對(duì)照組和miR-30b/c/d抑制組再灌

3、注時(shí)立即通過(guò)尾靜脈注射100ugEVs，損傷組注射同樣體積的M199細(xì)胞培養(yǎng)液。在再灌注24小時(shí)后，取腎臟及血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
　　腎臟組織內(nèi)細(xì)胞總線粒體分裂蛋白(Dynamin-related protein,DRP1)和線粒體DRP1表達(dá)情況應(yīng)用Western-blot進(jìn)行評(píng)估；腎組織內(nèi)和臍帶干細(xì)胞來(lái)源的微囊內(nèi) miR-30b/c/d表達(dá)以及 miR抑制劑的效用檢測(cè)應(yīng)用qRT-PCR進(jìn)行評(píng)估；微囊在腎組織內(nèi)的追蹤通過(guò)免疫熒光進(jìn)

4、行評(píng)估；腎小管上皮凋亡應(yīng)用caspase-9免疫組化及TUNEL染色法進(jìn)行評(píng)估；腎功能通過(guò)檢測(cè)血清肌酐（Scr）、尿素氮(BUN)濃度進(jìn)行評(píng)估。
　　體外實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)SD大鼠腎小管上皮原代細(xì)胞，以疊氮化鈉NaN3處理腎小管上皮細(xì)胞建立體外缺血再灌注損傷模型，損傷后給予 EVs或miR抑制劑處理后的EVs治療。應(yīng)用MitoTracker Red CMXRos熒光標(biāo)記上皮細(xì)胞線粒體，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成像評(píng)估線粒體動(dòng)態(tài)平衡（mitoc

5、hondrial dynamics）。
　　結(jié)果：
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在缺血再灌注條件下，腎臟組織內(nèi)miR-30b/c/d明顯降低，細(xì)胞總DRP1無(wú)明顯改變，而線粒體DRP1表達(dá)增高，小管上皮細(xì)胞凋亡增高，caspase-9表達(dá)增多，血清肌酐、尿素氮升高；經(jīng)EVs治療后，腎臟組織內(nèi)miR-30b/c/d表達(dá)恢復(fù)，線粒體DRP1下降，小管上皮凋亡減輕，caspase-9表達(dá)減少，血清肌酐、尿素氮降低，腎損傷減輕；而在miR抑制劑

6、處理過(guò)的EVs治療組中，EVs治療效果明顯下降。
　　體外實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)缺氧受損的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體動(dòng)態(tài)平衡被打破，傾向分裂，EVs治療后線粒體動(dòng)態(tài)平衡恢復(fù)，而miR抑制劑又抑制了這一效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)了miR-30和DRP1參與了EVs治療腎臟缺血再灌注損傷的修復(fù)機(jī)制，EVs能夠通過(guò)向腎小管上皮細(xì)胞傳遞 miR-30b/c/d來(lái)調(diào)控 DRP1，恢復(fù)線粒體動(dòng)態(tài)平衡，從而發(fā)揮抗凋亡作用，減輕腎損傷，保