地西他濱聯(lián)合三氧化二砷對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡的作用以及對(duì)DAPK基因影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一類起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，且其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。在過(guò)去的幾十年里，AML的治療已有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，目前治療的手段主要有聯(lián)合化療和在化療基礎(chǔ)上的造血干細(xì)胞移植。傳統(tǒng)化療的毒副作用和耐藥復(fù)發(fā)嚴(yán)重影響著患者的總體生存率，雖然骨髓移植是根治方法，但由于人類白細(xì)胞抗原不相合性以及移植后GVHD產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，故限制了其在臨床的廣泛開(kāi)展。因此，我們需要尋找新的

2、藥物來(lái)優(yōu)化治療方案，減少藥物的毒副作用以及交叉耐藥，以提高患者總體生存率。目前研究發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的發(fā)生率明顯增高，特別是那些具有抑癌功能的基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生的高甲基化。與基因突變不同，DNA甲基化是一種可逆轉(zhuǎn)的基因修飾過(guò)程，故在腫瘤或癌前病變中可以通過(guò)去甲基化處理恢復(fù)基因的表達(dá)，從而達(dá)到防治腫瘤的目的。因此，DNA去甲基化作用將為血液系統(tǒng)腫瘤的治療提供新思路。
　　地西他濱(decitabine，DAC)，

3、又稱為5-氮雜-2'-脫氧胞苷，作為一種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑對(duì)AML患者包括耐藥、復(fù)發(fā)患者已顯示出初步的療效。目前DAC已成功應(yīng)用于多種血液系統(tǒng)腫瘤，但在聯(lián)合應(yīng)用方面的研究仍比較少。三氧化二砷(arsenic trioxide，AS2O3)是我國(guó)從中醫(yī)藥中發(fā)掘出來(lái)的治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)效果肯定的藥物，已被美國(guó)NCCN的AML診療指南列為疾病持續(xù)不緩解或復(fù)發(fā)時(shí)挽救治療的首選用藥，是中西醫(yī)結(jié)合治療成功的經(jīng)典例證。
　

4、　近年來(lái)，去甲基化藥物不斷應(yīng)用于臨床，尤其是針對(duì)不適合應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化療方案誘導(dǎo)緩解的AML患者，然而如何提高藥物療效并減輕副作用是目前一重要課題。本實(shí)驗(yàn)研究DAC、A2O3對(duì)HL-60細(xì)胞（人急性髓系白血病細(xì)胞株）增殖、凋亡的作用以及對(duì)死亡相關(guān)蛋白激酶(death associatedprotein kinase，DAPK)基因表達(dá)的影響，探討去甲基化藥物治療AML的作用機(jī)制，旨在為今后臨床用藥提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:

5、　　選取AML細(xì)胞株HL-60為研究對(duì)象，并隨機(jī)分組:空白對(duì)照組，DAC單藥組(20μ mol/L、40μmol/L、80μmol/L)，AS2O3單藥組(1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L),DAC聯(lián)合AS2O3組(40μmol/L+2.5μmol/L、80μmol/L+2.5μmol/L、40μmol/L+5μmol/L、80μmol/L+5μmol/L), DAC預(yù)處理+AS2O3組(1μmol/L、2.5μmol

6、/L、5μmol/L)。評(píng)價(jià)不同濃度藥物干預(yù)不同時(shí)間后對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡的作用以及對(duì)DAPK基因表達(dá)水平的影響。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
　　1、用CCK8法初篩濃度并檢測(cè)不同濃度藥物作用24h、48h、72h對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制率;
　　2、用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)不同濃度藥物作用24h、48h、72h對(duì)HL-60細(xì)胞的凋亡率;
　　3、用RT-PCR法檢測(cè)不同濃度藥物作用HL-60細(xì)胞72h后DAPKm

7、RNA的表達(dá)水平;
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果:
　　1、DAC、AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響
　　1.1不同濃度的DAC、AS2O3單藥對(duì)HL-60細(xì)胞作用24h、48h、72h后，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制率逐漸升高。DAC對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制率由(10.97±1.09)％增加到(61.95±1.24)％，AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制率由(13.81±3.09)％增加到

8、(84.18±2.94)％。各處理組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00）。說(shuō)明DAC、AS2O3單藥能夠抑制HL-60細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間劑量依賴性。(Fig.1，F(xiàn)ig.2，Table1，Table2)
　　1.2不同濃度的DAC聯(lián)合AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞作用24h、48h、72h后，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制率由(43.22±4.78)％增加到(93.12±3.71)％，各處理組較單藥組比較增殖抑制率顯著

9、增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。說(shuō)明DAC聯(lián)合AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制作用具有協(xié)同作用。(Fig.3，Table3)
　　1.3經(jīng)DAC(80μmol/L)預(yù)處理后，不同濃度的AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞作用24h、48h、72h后，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制率由（31.8±1.32）％增加到(91.44±0.78)％，較AS2O3單藥組增殖抑制率顯著增加，各處理組間以及處理組與AS2O3單藥

10、組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。說(shuō)明DAC預(yù)處理可以增強(qiáng)AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用。(Fig.4，Table4)
　　2、DAC、AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響
　　2.1不同濃度的DAC、AS2O3單藥對(duì)HL-60細(xì)胞作用24h、48h、72h后，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率逐漸升高。DAC對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡率由（8.0±1.05）％增加到（36.6±1.35）％，AS2O3

11、對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡率由（10.2±1.35）％增加到(45.3±2.35)％。各處理組間以及處理組與對(duì)照組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。說(shuō)明DAC、AS2O3單藥能夠誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并呈時(shí)間劑量依賴性。(Fig.5，Table5，Table6)
　　2.2不同濃度的DAC聯(lián)合AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞作用24h、48h、72h后，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率由（19.6±0.56）％增加到（62

12、.1±0.71）％，各處理組較單藥組比較凋亡率顯著增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00）。說(shuō)明DAC聯(lián)合AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡具有協(xié)同作用。(Fig.5，Table7)
　　2.3經(jīng)DAC(80μmol/L)預(yù)處理后，不同濃度的AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞作用24h、48h、72h后，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率由（18.8±1.32）％增加到（71.4±0.79）％，較AS2O3單藥組凋亡率顯著增加，

13、各處理組間以及處理組與AS2O3單藥組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00）。說(shuō)明DAC預(yù)處理可以增強(qiáng)AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。(Fig.5，Table8)
　　3、DAC、AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞DAPKmRNA表達(dá)的影響
　　3.1不同濃度的DAC、AS2O3單藥對(duì)HL-60細(xì)胞作用72h后，隨著藥物濃度的增加，DAPKmRNA的表達(dá)水平逐漸升高。DAC對(duì)DAPKmRNA的表達(dá)量由1.5±0.34增加到

14、3.2±0.56，AS2O3對(duì)DAPKmRNA的表達(dá)量由1.2±0.50增加到3.0±0.17。各處理組間以及處理組與對(duì)照組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。說(shuō)明DAC、AS2O3單藥能夠增加HL-60細(xì)胞DAPKmRNA的表達(dá)水平，并呈劑量依賴性。(Fig.6，F(xiàn)ig.7，Table9，Table10)
　　3.2不同濃度的DAC聯(lián)合AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞作用72h后，隨著藥物濃度的增加，DAPKmRNA的表達(dá)量由3

15、.6±0.47增加到5.2±0.25，各處理組與單藥組及對(duì)照組比較，DAPKmRNA的表達(dá)量顯著升高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。說(shuō)明DAC聯(lián)合AS2O3能夠增加HL-60細(xì)胞DAPKmRNA的表達(dá)水平，且兩者具有協(xié)同作用。(Table11)
　　3.3經(jīng)DAC(80μmol/L)預(yù)處理后，不同濃度的AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞作用72h后，隨著藥物濃度的增加，DAPKmRNA的表達(dá)量由2.0±0.35增加到4.5±0.

16、18，較AS2O3單藥組基因的表達(dá)水平顯著升高，各處理組間以及處理組與AS2O3單藥組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。說(shuō)明DAC預(yù)處理可以提升AS2O3對(duì)HL-60細(xì)胞DAPKmRNA的表達(dá)水平。(Table12)
　　結(jié)論:
　　1、地西他濱和三氧化二砷單藥及聯(lián)合對(duì)HL-60細(xì)胞均有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，且呈時(shí)間劑量依賴性。
　　2、地西他濱和三氧化二砷發(fā)揮作用具有協(xié)同效應(yīng)。
　　3、經(jīng)地西他濱預(yù)處