柑橘皮渣降解菌的篩選及其相關特性研究.pdf

1、我國是世界上主要的柑橘生產(chǎn)國之一，在江西，四川，湖南，湖北，重慶，四川等地區(qū)廣泛栽培。在2011年，柑橘種植面積和產(chǎn)量均達到世界第一，分別達到2.21×106hm2和2.91×107t。目前，我國每年約加工柑橘1.01×106t，約產(chǎn)生柑橘皮渣5.06×105t，隨著柑橘加工業(yè)的發(fā)展，柑橘皮渣的量逐漸增加。加工后產(chǎn)生的大量柑橘皮渣，未經(jīng)處理極易發(fā)生腐敗，污染水體和土壤，危害環(huán)境，嚴重影響人們的生活健康。因此柑橘皮渣問題逐步引起人們的關注

2、，亟待無害化處理。
　　目前，對柑橘皮渣的處理方式主要有衛(wèi)生填埋、烘干作動物飼料、提取有效活性物質。衛(wèi)生填埋處理需要占用大量耕地，且產(chǎn)生大量滲透液和臭氣，嚴重污染環(huán)境。柑橘皮渣含水量高(＞80％)和大量果膠(20％)，加之果膠與水形成吸附水，烘干作動物飼料耗能大，成本高，難以推廣。提取柑橘皮渣中有效活性物質，如香精油、色素、果膠和類黃酮物質，增加了皮渣的附加產(chǎn)值，但是并沒有有效減少皮渣，反而在一定程度上增加了廢棄物的體積和種類，造

3、成了更嚴重的危害。因此，目前柑橘皮渣的處理方式并未有效處理皮渣，柑橘皮渣已成為限制柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。
　　柑橘皮渣中含有約20％果膠和15％纖維素，大量水與果膠結合以吸附水的形式存在，增加了皮渣自然脫水難度;皮渣中高分子的纖維素和果膠的物質，增加了微生物對皮渣的降解難度;此外，柑橘皮渣中還含有約0.3％～0.8％的香精油，對絕大部分革蘭氏細菌的生長有抑制作用，同時加工后的含有的有機酸，皮渣pH降低，導致普通微生物難于降解

4、。
　　因此，本研究以柑橘果園土壤和農(nóng)田堆肥為菌源，采用柑橘香精油耐受性、剛果紅染色等多種分離篩選方法，篩選出了高效優(yōu)良降解柑橘皮渣的菌株L207和L702;并對其最佳產(chǎn)酶條件以及對柑橘皮渣的降解能力進行相關研究，最后對其生物學地位進行了鑒定，試驗結果如下:
　　1、柑橘皮渣降解菌的分離篩選:將采集到的土樣接入不同培養(yǎng)基中，分離獲得細菌五株，編號為L106、L202、L207、L309、L702。根據(jù)菌株對柑橘香精油耐受性、

5、纖維素酶和果膠酶活性高低結果，篩選出優(yōu)良的皮渣降解菌L207和L702。結果表明:
　　(1)采用濾紙片擴散法測定香精油對菌株的抑菌圈直徑大小，發(fā)現(xiàn)在相同濃度的香精油條件下，菌株L207和L702的抑菌圈直徑小于其他供試菌株，說明其對柑橘香精油具有較好的耐受作用;采用連續(xù)稀釋培養(yǎng)法，將菌株L207和L702在不同濃度精油培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)L207和L702均在精油濃度為25.0％的培養(yǎng)基能夠生長，超過該濃度不能存活，說明對柑橘香精

6、油的最大耐受濃度達到25.0％，是兩株對柑橘香精油有較高耐受能力的菌株。
　　(2)分別以羧甲基纖維素鈉和果膠為唯一碳源，采用剛果紅染色，發(fā)現(xiàn)菌株L207和L702的水解圈直徑明顯大于CK菌株;對CK菌株、菌株L207和L702進行搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)，測得其纖維素酶活性大小關系為:L702＞L207＞CK，分別為CK的2.08倍和1.01倍，差異性顯著（p=0.05）;其果膠酶活性大小關系為:L207＞L702＞CK，分別為CK的12.

7、68倍和7.30倍，差異性顯著(p=0.05)。表明菌株L207和L702是兩株纖維素和果膠酶活性較強的菌株。
　　2、對菌株L207和L702產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，結果表明:菌株L207的纖維素酶和果膠酶的最佳產(chǎn)酶條件具有基本一致性，即均在培養(yǎng)溫度為40℃、pH6.0、培養(yǎng)時間為48h至60h、接種量為4％(V/V)的條件下達到最大值;菌株L702的纖維素酶活性在培養(yǎng)溫度為40℃、pH6.0、培養(yǎng)時間在48 h至60h、接種量為4％

8、(V/V)條件下達到最大值;果膠酶活性在培養(yǎng)溫度為40℃、pH6.0、培養(yǎng)時間為36 h和72h、接種量為6％(V/V)達到最大值。
　　3、菌株L207和L702生物學鑒定:通過形態(tài)學觀察、生理生化特征和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，得知菌株L207和L702菌落均呈乳白色且不透明，有稍微隆起，表面濕潤，有少許特殊氣味;均屬于革蘭氏陽性菌，芽孢為橢圓形，且居中不膨大?；诨蚱涡蛄械耐葱员容^分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)菌株L207和L70

9、2與Bacilluslicheniformis中E9和DQgbc4相似。綜上，可鑒定菌株L207和L702為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。
　　4、菌株L207和L702對柑橘皮渣的實際降解效果測定結果顯示:堆置50d后，皮渣堆肥中纖維素降解率達到84.45％，果膠降解率達到65.93％;含水量為16.57％(≤20％)，總養(yǎng)分含量為4.71％(≥4.0％)，均達到國家有機肥標準(NY525-200