諾卡菌secA1基因菌種鑒定及環(huán)丙沙星耐藥機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：
　　諾卡菌是一種機(jī)會致病菌，隨著其感染率的增加以及耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，逐漸引起人們的重視。鑒于16s rRNA基因在諾卡菌近緣種分型方面的缺陷，以及環(huán)丙沙星耐藥鼻疽諾卡菌菌株的發(fā)現(xiàn)，本論文對中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所生物安全實驗室分離并保存的諾卡菌進(jìn)行研究，旨在分析secA1基因在諾卡菌菌種中的鑒定分型能力，研究其在臨床鑒定中的應(yīng)用價值；并對鼻疽諾卡菌關(guān)于喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星的耐藥機(jī)制進(jìn)行初步探索，為指導(dǎo)臨床合理使

2、用抗生素以及控制耐藥菌株的傳播提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1. secA1基因用于諾卡菌菌種鑒定分型的研究：
　　對59株諾卡菌的secA1基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段純化后測序，并從GenBank數(shù)據(jù)庫下載32株諾卡菌secA1基因序列進(jìn)行補充，采用 Lasergene7.0軟件對所有序列計算種內(nèi)與種間相似度水平，并用MEGA6.06軟件的N-J法構(gòu)建諾卡菌菌種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
　　2.鼻疽諾卡菌耐藥基因

3、gyrA、gyrB突變位點的檢測與分析：
　　選取20株鼻疽諾卡菌，其中環(huán)丙沙星耐藥菌株和敏感菌株各10株，對其耐藥基因gyrA、gyrB的QRDR擴(kuò)增后測序，采用Mega6.06軟件對測序得到的基因序列與GenBank下載的鼻疽諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株IFM10152的gyrA、gyrB基因序列進(jìn)行比對分析。
　　3.外排泵抑制劑對鼻疽諾卡菌環(huán)丙沙星敏感性的影響：
　　采用微量肉湯稀釋法檢測上述20株鼻疽諾卡菌，關(guān)于環(huán)丙沙星及

4、外排泵抑制劑羰基氫氯苯腙、甲硫噠嗪、氯丙嗪的MIC，選取阿爾瑪藍(lán)試劑作為顯色液。分別在三種泵抑制劑1/2MIC和1/4MIC的濃度條件下，檢測20株鼻疽諾卡菌環(huán)丙沙星MIC值的變化。
　　4.鼻疽諾卡菌外排泵基因及孔蛋白基因表達(dá)量變化的初步研究：
　　根據(jù)GenBank中已發(fā)布的鼻疽諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株IFM10152全基因組序列及其注釋，選取管家基因secA作為內(nèi)參基因，選取2個孔蛋白基因nfa15890、nfa49590及23

5、個MFS家族假定藥物外排泵基因進(jìn)行研究。對上述20株菌株進(jìn)行無環(huán)丙沙星和亞抑菌濃度(1/4 MIC)環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)培養(yǎng)，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄，并采用RT-PCR檢測其表達(dá)量變化，采用公式2-ΔΔCT計算待測基因相對表達(dá)量差異倍數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1. secA1基因用于諾卡菌菌種鑒定分型的研究：
　　91株受試諾卡菌 secA1基因的種內(nèi)相似度為97.2％~100%，平均相似度達(dá)98.6%；種間相似度為85.2%~98

6、.4%，平均相似度達(dá)91.8%。以secA1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，16種諾卡菌被準(zhǔn)確分離為16個獨立的分支，諾卡菌近緣種新星諾卡菌復(fù)合體、少食/短鏈諾卡菌復(fù)合體均可有效分離。
　　2.鼻疽諾卡菌耐藥基因gyrA、gyrB突變位點的檢測與分析：
　　20株鼻疽諾卡菌中，發(fā)現(xiàn)有6株gyrA基因在第294位點出現(xiàn)堿基由胞嘧啶到鳥嘌呤（C-G）的點突變，突變率為30%。其中環(huán)丙沙星耐藥菌株2株，敏感菌株4株，然而突變前后其編碼

7、的氨基酸未發(fā)生改變，均為精氨酸，屬于無義突變。20株鼻疽諾卡菌中，未發(fā)現(xiàn)gyrB基因突變位點。
　　3.外排泵抑制劑對鼻疽諾卡菌環(huán)丙沙星敏感性的影響：
　　泵抑制劑應(yīng)用之前，20株鼻疽諾卡菌中環(huán)丙沙星MIC值8μg/ml的菌株有3株，4μg/ml的菌株有7株，1μg/ml的菌株有2株，0.5μg/ml的菌株有8株；三種泵抑制劑應(yīng)用之后，環(huán)丙沙星 MIC值均降低至小于等于0.125μg/ml，降低倍數(shù)在4倍至64倍之間，泵抑制

8、劑應(yīng)用前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.鼻疽諾卡菌外排泵基因表達(dá)量變化的初步研究：
　　與無環(huán)丙沙星誘導(dǎo)壓力時的外排泵基因表達(dá)量相比，在環(huán)丙沙星1/4MIC的誘導(dǎo)壓力下，耐藥菌株中高表達(dá)（即相對表達(dá)量差異倍數(shù)≥4）的外排泵基因有三個，分別為nfa56470、nfa29840、nfa34160，其高表達(dá)的菌株數(shù)量分別為10株、7株、1株；敏感菌株中未見高表達(dá)的外排泵基因。對環(huán)丙沙星耐藥組與敏感組各外排泵基因相對表達(dá)量變化進(jìn)行兩獨

9、立樣本t檢驗，具有統(tǒng)計學(xué)差異的外排泵基因有8個，分別為 nfa11010（P=0.04）、nfa21830（P=0.03）、nfa25500（P=0.03）、nfa29840（P=0.05）、nfa34160（P=0.02）、nfa38830（P=0.00）、nfa56470（P=0.04）、nfa9390（P=0.04）。
　　5.鼻疽諾卡菌孔蛋白基因表達(dá)量變化的初步研究：
　　與無環(huán)丙沙星誘導(dǎo)壓力時的孔蛋白基因表達(dá)量相比

10、，在環(huán)丙沙星1/4MIC的誘導(dǎo)壓力下，耐藥菌株與敏感菌株孔蛋白基因的相對表達(dá)量均有所降低，但降低倍數(shù)均在四倍以下。對環(huán)丙沙星耐藥組與敏感組孔蛋白基因的相對表達(dá)量變化進(jìn)行兩獨立樣本t檢驗，P值分別為0.59（nfa15890）和0.68（nfa49590），認(rèn)為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、secA1基因序列分析為諾卡菌菌種的鑒定分型提供了一種新方法，對諾卡菌屬可進(jìn)行較好的鑒定和分型，尤其在諾卡菌近緣種的分型方面有獨