舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)lncRNAs的研究.pdf

1、舌鱗癌是口腔鱗癌中發(fā)生率最高的惡性腫瘤，常在腫瘤早期即發(fā)生區(qū)域性頸淋巴轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的治療和預(yù)后。據(jù)統(tǒng)計(jì)，無(wú)頸淋巴轉(zhuǎn)移舌鱗癌患者的5年生存率大于50％，而有頸淋巴轉(zhuǎn)移舌鱗癌患者的5年生存率則小于30％。目前臨床上對(duì)于舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清晰，對(duì)其早期診斷及干預(yù)治療仍缺乏有效的手段。因此，深入了解舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找有效的早期診斷、干預(yù)舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移的新途徑，對(duì)于改善預(yù)后、提高患者的生存質(zhì)量具有重要意義。
　　長(zhǎng)

2、鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200核苷酸，不具備蛋白編碼功能的RNA。越來(lái)越多的研究顯示lncRNA能夠在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后等水平調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程并與腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　LncRNA是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的能夠參與多種病理生理過(guò)程并發(fā)揮重要作用的RNA，其在頭頸腫瘤中的研究剛剛起步，在舌鱗癌中的研究鮮有報(bào)道，其在舌鱗癌中的作用機(jī)制尚不清晰。并且尚未有學(xué)者研究

3、與舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因芯片篩選并進(jìn)一步研究與舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA，為舌鱗癌的診斷和治療提供新的方向。
　　本研究分為以下三部分:
　　第一部分 舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)lncRNAs的篩選。
　　目的：
　　通過(guò)lncRNA表達(dá)譜芯片，探索可能與舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA及其調(diào)控方式，為后續(xù)研究提供方向。
　　方法：
　　1.基因芯片檢測(cè)舌鱗癌組織中l(wèi)n

4、cRNA表達(dá)譜的差異;
　　2.采用生物信息學(xué)分析探索lncRNA在舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)lncRNA芯片檢測(cè)出在無(wú)頸淋巴轉(zhuǎn)移舌鱗癌組織和頸淋巴轉(zhuǎn)移舌鱗癌組織中表達(dá)量有顯著差異的lncRNA2210個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)者1188種，表達(dá)下調(diào)者1022種。篩選出了可能和舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的兩個(gè)lncRNA:NR_002819(MALAT1)（表達(dá)下調(diào)）和NR_002323(TUG1)（表達(dá)

5、上調(diào)）;
　　2.構(gòu)建可能影響舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子及其調(diào)控方式圖。
　　結(jié)論：
　　多種lncRNA在無(wú)頸淋巴轉(zhuǎn)移舌鱗癌組織和頸淋巴轉(zhuǎn)移舌鱗癌組織的lncRNA表達(dá)譜中存在明顯差異，它們可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)因子直接或間接參與調(diào)控舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移，尤其是肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)及?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)與舌鱗癌的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。
　　第二部分 舌鱗癌組織中差異lncRNAs表達(dá)水平的驗(yàn)證。<

6、br>　　目的：
　　進(jìn)一步驗(yàn)證MALAT1、TUG1在舌鱗癌轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)情況，選擇具有顯著差異的lncRNA進(jìn)行后期研究。
　　方法：
　　利用Q-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)舌鱗癌組織和癌旁正常組織中MALAT1及TUG1的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證并分析。
　　結(jié)果：
　　1.在轉(zhuǎn)移組中，對(duì)比癌旁正常組織，癌組織中MALAT1的表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.001);
　　2.在無(wú)轉(zhuǎn)移組中，對(duì)比癌旁正常組織，癌組織

7、中MALAT1的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.001);
　　3.轉(zhuǎn)移組與無(wú)轉(zhuǎn)移組相比，對(duì)比無(wú)轉(zhuǎn)移組癌組織，轉(zhuǎn)移組癌組織中MALAT1的表達(dá)量顯著下調(diào)(P＜0.001)，與芯片結(jié)果一致;對(duì)比無(wú)轉(zhuǎn)移組癌旁正常組織，轉(zhuǎn)移組癌旁正常組織中MALAT1的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.001);
　　4.對(duì)比無(wú)轉(zhuǎn)移組癌組織，TUG1在轉(zhuǎn)移組癌組織中稍有下調(diào)，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　從Q-PCR結(jié)果分析得出，無(wú)

8、論在轉(zhuǎn)移組還是無(wú)轉(zhuǎn)移組，MALAT1在癌旁正常組織和癌組織中表達(dá)量都具有顯著性差異，這說(shuō)明MALAT1在舌鱗癌的發(fā)生中具有一定作用。未發(fā)生頸淋巴轉(zhuǎn)移舌鱗癌的癌組織中MALAT1的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，而發(fā)生頸淋巴轉(zhuǎn)移舌鱗癌的癌組織中MALAT1的表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，這說(shuō)明MALAT1的表達(dá)量在舌鱗癌發(fā)生頸淋巴轉(zhuǎn)移前后有了顯著變化。對(duì)比轉(zhuǎn)移組和無(wú)轉(zhuǎn)移組癌組織，轉(zhuǎn)移組中MALAT1的表達(dá)量明顯低于無(wú)轉(zhuǎn)移組，提示MALAT1的表

9、達(dá)水平可能與舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，MALAT1在舌鱗癌頸淋巴轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制值得進(jìn)一步研究。
　　第三部分 MALAT1對(duì)舌鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。
　　目的：
　　檢測(cè)MALAT1在舌鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，利用體外實(shí)驗(yàn)研究MALAT1對(duì)舌鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。
　　方法：
　　1.Q-PCR檢測(cè)舌鱗癌細(xì)胞系中MALAT1的表達(dá)情況;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)舌鱗癌細(xì)胞系的遷移能力;
　　

10、2.構(gòu)建MALAT1的有效干擾慢病毒及陰性對(duì)照;
　　3.CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MALAT1表達(dá)下調(diào)對(duì)舌鱗癌細(xì)胞體外增殖能力的影響;
　　4.細(xì)胞劃痕和transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MALATI表達(dá)下調(diào)對(duì)舌鱗癌細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.MALAT1在舌鱗癌細(xì)胞系CAL-27、SCC15、Tca8113中表達(dá)水平較高(△Ct值≤12)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:CAL-27細(xì)胞遷移率為57％;SC

11、C15細(xì)胞遷移率為63％，均可進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。Tca-8113細(xì)胞遷移率為24％，不適宜進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn);
　　2.成功構(gòu)建MALAT1的有效干擾慢病毒LV-MALAT1-RNAi(25688-1)及陰性對(duì)照慢病毒CON077;
　　3.CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，MALAT1表達(dá)下調(diào)可抑制舌鱗癌細(xì)胞的體外增殖能力:在CAL-27、Tca8113細(xì)胞中，細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著降低(P＜0.01)，在SCC15細(xì)胞中稍有降低，但無(wú)顯著性差異(P

12、＞0.05);
　　4.細(xì)胞劃痕和transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，MALAT1表達(dá)下調(diào)可顯著抑制舌鱗癌細(xì)胞CAL-27、SCC15的體外遷移能力(P＜0.05);MALAT1表達(dá)下調(diào)可顯著抑制舌鱗癌細(xì)胞CAL-27、SCC15的侵襲能力(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.MALAT1在舌鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平與舌鱗癌細(xì)胞系的遷移能力成正比。
　　2.MALAT1可在轉(zhuǎn)染MALAT1-shRNA的舌鱗癌細(xì)胞系中