星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43及其半通道在腦缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、缺血性腦血管疾病是臨床神經(jīng)內(nèi)科的常見疾病，其治療發(fā)展過程中的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)被認(rèn)為是比疾病本身更具有破壞性，通常是決定預(yù)后的關(guān)鍵因素。腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要病理表現(xiàn)，目前關(guān)于前者的研究較多，而后者的研究很少。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大，在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)分布最廣泛，同時(shí)它比腦內(nèi)其他細(xì)胞具有更廣泛的縫隙連接(Gap juncti

2、ons，GJs)。縫隙連接是相鄰細(xì)胞間細(xì)胞膜上傳遞信息的物質(zhì)管道，由兩個(gè)半通道(Hemichannel，HC)構(gòu)成?？p隙連接蛋白是構(gòu)成該通道的蛋白，其含量最多、分布最廣泛的是連接蛋白43(Connexin43，Cx43)，目前被證實(shí)跟各種顱腦損傷以及細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)使用缺血再灌注損傷體外模型（細(xì)胞氧葡萄糖剝奪-再恢復(fù)模型），通過對(duì)Cx43、半通道抗體1(HC1)和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物—半胱天冬蛋白酶3(Caspas

3、e3，Casp3)表達(dá)的檢測，從細(xì)胞水平探討星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43及其半通道與細(xì)胞凋亡的關(guān)系以及在腦缺血再灌注損傷中二者可能起的作用。
　　目的：
　　通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行氧葡萄糖剝奪-再恢復(fù)(oxygen-glucose deprivationreoxygenation，OGDR)處理，研究Cx43及其半通道對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響以及與星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討Cx43及其半通道可能在缺血再灌注損傷中的作用，從而為缺血性腦血管

4、疾病的治療和預(yù)后提供新的理論基礎(chǔ)和治療指南。
　　方法：
　　人類大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞株通過細(xì)胞培養(yǎng)，使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，glial fibrillary acidic protein，GFAP)、Cx43及HC1以鑒定其表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和特異性Cx43-shRNA轉(zhuǎn)染后分為三組，分別為cell line組（正常細(xì)胞株）、Psup組（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）和shRNA組（特異性Cx

5、43-shRNA轉(zhuǎn)染），通過免疫印跡法對(duì)每組Cx43和HC1的表達(dá)進(jìn)行檢測。每組細(xì)胞分別給予OGDR處理，各組內(nèi)未處理細(xì)胞作為對(duì)照組。在不同的氧葡萄糖再恢復(fù)時(shí)間0hour、4hours和24hours(0h、4h、24h)，用MTT法檢測各組細(xì)胞活性，通過免疫印跡法檢測各組Cx43，HC1和Casp3的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞可見Cx43+GFAP和HC1+GFAP的表達(dá)，鑒定結(jié)果為星形膠質(zhì)細(xì)胞，且細(xì)胞膜

6、存在Cx43及其半通道的表達(dá)。
　　2.Cell line組和Psup組細(xì)胞中都有Cx43和HC1的表達(dá)，但在shRNA組中沒有Cx43和HC1的表達(dá)，轉(zhuǎn)染成功。
　　3.OGDR后cell line組和Psup組星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活性在氧葡萄糖再恢復(fù)4h明顯下降，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，而在氧葡萄糖恢復(fù)0h和24h的細(xì)胞活性與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05);shRNA組星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧葡萄糖

7、再恢復(fù)0h、4h和24h的細(xì)胞活性與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。
　　4.OGDR后cell line組和Psup組星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43、HC1和Casp3的表達(dá)在氧葡萄糖再恢復(fù)4h明顯升高，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，而在氧葡萄糖恢復(fù)0h和24h的表達(dá)與對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）;shRNA組星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43、HC1和Casp3在氧葡萄糖再恢復(fù)0h、4h和24h的表達(dá)與對(duì)照

8、組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.腦缺血再灌注損傷早期星形膠質(zhì)細(xì)胞存活力降低，Cx43及其半通道可能起促進(jìn)作用。
　　2.腦缺血再灌注損傷早期星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增多，Cx43及其半通道可能促進(jìn)了細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)而在預(yù)測早期腦缺血再灌注損傷方面起關(guān)鍵作用。
　　3.雖然本研究中特異性Cx43-shRNA轉(zhuǎn)染是作為一種分析工具，但臨床中可能為改善缺血再灌注損傷后的腦細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡提供